Cell | 中山大学团队使用多重免疫组化、单细胞测序等技术揭示免疫建立与耐受新机制

妊娠中期是免疫系统发育的关键窗口。在此阶段，免疫谱系以与成人免疫非常相似的模式在器官间扩展、成熟和分布。这些过程为先天免疫和适应性免疫奠定了细胞基础，使婴儿出生后能够得到保护。传统观点认为胎儿免疫系统基本处于静止状态。然而，最近的研究表明，在早期微生物暴露和内在转录调控的驱动下，胎儿免疫细胞实际上已表现出功能启动和反应性。尽管已有这些发现，但对于胎儿发育过程中出现这种活跃免疫现象的原因，仍知之甚少。

研究方法

研究者使用单细胞测序技术（scRNA-seq，scTCR-seq）比较分析胎儿和成人免疫系统之间免疫细胞在多个器官中的免疫组成、分布和相互作用。为验证这些细胞亚群的存在，研究者利用流式细胞术（FACS）和多重免疫组化（mIHC）技术对不同器官进行了分析，证实了这些免疫细胞在胎儿发育阶段的多个器官中均有分布。

mIHC抗体panel为：

1. CD3, CD4, IKZF2, FOXP3

2. CD3, CD4, CD8, CD45RO

3. CD3, CD8, GZMK

4. CD3, CD4, CD8, CD103

 

主要结果

 

1.中期妊娠胎儿和成人的综合免疫图谱

为了系统地阐明妊娠中期各器官的免疫组成，并将其与成人的免疫组成进行比较，研究者对来自321个样本的免疫细胞进行了scRNA-seq和TCR-seq，这些样本覆盖了来自15个胎儿和4个成人供体的23个器官。基于平均基因表达的主成分分析显示，胎儿与成人样本间存在明显分离，表明二者具有不同的免疫细胞组成。细胞被聚集成54种主要类型，注释了主要的细胞类型。基于基因表达的分层聚类分析将胎儿和成人样本中的谱系组合在一起，胎儿器官已经包含类似于成人的细胞类型，强调妊娠中期是免疫细胞分化为复杂免疫系统的关键阶段。比较胎儿和成人器官之间的免疫细胞差异。在多个胎儿器官中，前体、幼稚和增殖性细胞簇占主导地位，而在成人中，记忆和活化的T细胞以及两种血浆细胞亚群富集。这些基于单细胞分辨率的观察证实，妊娠中期的胎儿免疫系统虽不成熟但高度增殖，与成人免疫系统存在显著差异。

 

图1 . 妊娠中期胎儿和成人器官的免疫细胞图谱

值得注意的是，前体T细胞在胸腺以外的多个器官中广泛分布。在胸腺中，前体细胞高表达TOX2，但低表达CD4、CD8A和CD8B，这与它们从双阳性到单阳性状态的已知过渡特征一致，通常局限于胸腺。相反，在胸腺外器官中发现的外胸腺前体细胞（ET）显示出显著较低的TOX2，缺乏CD8A/CD8B，较高的CCR7和SELL，并评估了CD4的比例，将其区分为原始CD4⁺T细胞群体中的独特亚群。这些ET细胞在胸腺祖细胞（TP）细胞和成熟幼稚CD4⁺T细胞之间显示中间分值，并且它们定位于TP细胞、成熟的初始CD4⁺T细胞和Treg细胞之间的连接处，这表明ET细胞起源于TP，并通过外周循环，进而向其他成熟的初始CD4⁺T细胞状态过渡。为了验证ET细胞的存在，研究者在不同器官中进行了多重荧光活化的细胞分选（FACS）和多重免疫组化（mIHC）技术进行测定，这证实了ET细胞在整个胎儿发育阶段在多个器官中的广泛分布。

图2.ET和CD4⁺T细胞亚群的发育轨迹和转录谱

3.功能性造血干细胞在多个胎儿器官中广泛分布

根据CD34和造血干细胞特异性转录因子HLF在多个胎儿组织中的表达，研究者鉴定了7050个细胞的造血干细胞簇。HLF⁺HSC分布于多个胎儿器官，其范围超出了肝、脾和骨髓等传统造血器官，提示在妊娠中期，HSC可能在不同胎儿器官间迁移或定植。此外，这些HSC表现出类似于成熟肝HSC的基因表达谱，高表达主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类基因。

为了验证HSC的真实性，研究者进行了mIHC检测，并确认了胎儿发育过程中心脏、肝脏、脾脏和皮肤组织中血管外（CD34）存在CD45⁺CD34⁺HLF⁺HSC。进一步的FACS分析在发育过程中的多个胎儿器官中检测到CD45⁺CD34⁺Lin⁻CD38⁻CD90⁺CD45RA⁻HSC的占比，范围从血液中0.0013%的免疫细胞到肝脏中4.16%。为了探索这些造血干细胞的造血潜力，使用来自心脏和肝脏的CD45⁺CD34⁺Lin⁻CD38^-CD90⁺CD45RA⁻造血干细胞（作为阳性对照）进行了集落形成单位（CFU）检测，产生了代表多个谱系的集落。随后的scRNA-seq分析表明，分化的HSC中多个血液细胞谱系的细胞组成不均匀。肝源性HSC优先产生髓系谱系，包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞；相反，心脏来源的造血干细胞主要偏向肥大和红系细胞，表明这两个器官中的造血干细胞发育潜力不同。这些发现表明，在妊娠中期，多个器官中有活跃的造血。

图3 胎儿发育过程中功能性造血干细胞的广泛分布

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