【客户文章】港大团队开发出抗自相残杀和耗竭的CCR4/CD7双特异性CAR-T细胞，单细胞测序技术深入剖析其优势背后的分子机制
近年来，CAR-T细胞疗法在治疗B细胞恶性肿瘤方面取得了举世瞩目的成就。然而，当“以T细胞攻T细胞”时，科学家们却面临了严峻的挑战：由于目标靶点（如CD7）同样表达在健康的CAR-T细胞表面，导致CAR-T细胞在制备过程中就相互攻击，即发生“自相残杀（Fratricide）”；此外，治疗后的肿瘤免疫逃逸（如CD7抗原丢失）和CAR-T细胞自身的功能耗竭（Exhaustion），也严重限制了其疗效和持久性。
面对这些难题，香港大学李嘉诚医学院的团队另辟蹊径，成功开发出一种新型的CCR4/CD7双特异性CAR-T细胞，巧妙地规避了上述障碍。这项研究成果近日发表在顶级期刊 《Advanced Science》 上。
在这项研究中，云准科技非常荣幸地提供了关键的单细胞RNA测序（scRNA-seq）及生物信息学分析服务，助力研究人员深入剖析了这种创新CAR-T细胞的独特生物学特性，为理解其功能优势提供了前所未有的微观视角。
为了克服T细胞恶性肿瘤治疗中的多重障碍，研究团队设计了一套精密的“组合拳”：
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源头解决自相残杀：CD7阴性细胞作为“种子”。研究人员首先利用免疫磁珠法，从健康供者的PBMCs中直接去除CD7阳性的T细胞，仅保留CD7阴性（CD7N）的T细胞作为制备CAR-T的原料。这些细胞天然不表达CD7，从根本上杜绝了因靶向CD7而可能发生的自相残杀。实验证明，CD7N细胞在IL-7/IL-15的培养条件下展现出强大的扩增能力。
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双靶点设计，堵死逃逸路径。考虑到部分T细胞肿瘤（尤其是成熟T细胞肿瘤）CD7表达缺失或较低，而CCR4在这些恶性肿瘤（如ATLL、CTCL）中高表达，团队构建了一个靶向CCR4和CD7的双特异性串联CAR。这使得CAR-T细胞能同时识别两个靶点，有效降低了因单一抗原丢失导致的肿瘤复发风险，扩大了治疗范围。
图 CCR4/CD7双特异性CAR-T细胞的制备与表征
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过表达c-Jun，赋予“抗耗竭”超能力。为了增强CAR-T细胞的“耐力”，研究人员在CAR结构中引入了转录因子c-Jun。实验结果显示，过表达c-Jun的CD7N CAR-T细胞（CD7N CAR-T-C-JUN）在经过反复的肿瘤细胞攻击后，仍能保持强大的杀伤能力，且其表面的耗竭标志物LAG-3表达水平显著降低，展现了卓越的功能持久性。
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内置“安全开关”，随时响应。为了应对可能出现的严重副作用（如细胞因子风暴），团队还在CAR-T细胞上整合了一个截短的表皮生长因子受体（EGFRt） 作为“自杀开关”。一旦发生严重不良事件，只需使用临床药物西妥昔单抗，即可精准、高效地清除体内的CAR-T细胞，为疗法的安全性上了双保险。
为了探究这些经过精心设计的CD7N CAR-T细胞为何功能如此强大，研究团队将目光投向了单细胞水平。这正是本研究的点睛之笔。
我们云准科技协助客户完成了以下关键的单细胞测序实验和数据分析工作：
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样本处理：将CD7N CAR-T、未经分选的Bulk CAR-T以及未转导的CD7N T细胞（NT CD7N）与肿瘤细胞（Jurkat）共培养24小时，然后通过流式细胞术精准分选出CAR阳性的T细胞，进行10x Genomics单细胞3‘转录组测序。
图 示意图展示了CD7N CAR-T、Bulk CAR-T及NT CD7N三组细胞的转录组分析实验设计
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数据分析：通过专业的生物信息学流程，对测序数据进行质控、聚类、差异基因表达分析、功能富集分析、细胞轨迹分析和细胞间相互作用分析。
单细胞测序揭示的三大关键发现：
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独特的细胞图谱：通过无监督聚类，研究团队在CD7N CAR-T、Bulk CAR-T和NT CD7N三组样本中鉴定出9个不同的T细胞亚群。其中，CD4+ T细胞占据了主要部分，并可细分为Th1、Th2、Treg等7个亚群。值得注意的是，CD7N CAR-T组的细胞亚群分布更为均衡，而Bulk CAR-T则富集了Th1/Th2/Naive细胞。
图 双特异性CD7N CAR-T细胞的转录组图谱
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发现关键的AQP3+增殖性CD4+ T细胞亚群：在所有的细胞亚群中，一个名为cluster 3的细胞群引起了研究人员的特别关注。这是一个AQP3+ Ki-67+的增殖性CD4+ T细胞亚群。分析发现，相比于Bulk CAR-T和NT CD7N组，CD7N CAR-T组中的这个亚群显著富集，并高表达一系列关键基因：
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高表达SOS1和KLF2：SOS1是Ras/MAPK信号通路的关键分子，对T细胞增殖至关重要；而KLF2近期被证实能抑制CD8+ T细胞耗竭，维持谱系完整性。它们的共表达，为CD7N CAR-T细胞的抗耗竭能力和持久性提供了分子基础。
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高表达BIRC3等凋亡抑制基因：BIRC3编码的cIAP2蛋白能调控TNF-α介导的NF-κB激活，促进细胞存活，避免凋亡。
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兼具增殖和记忆特征：该亚群同时高表达增殖相关基因（如TYMS, TOP2A）和记忆相关基因（如CCR7, TCF7, IL7R），呈现出一种兼具强大扩增能力和长期记忆潜能的独特状态。
图 CD7N CAR-T中第3簇细胞的轨迹分析与细胞互作
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激活Src/Ras/ERK和Bcl-2通路：进一步的GO功能富集分析表明，与NT CD7N细胞相比，CD7N CAR-T细胞中高表达的基因显著富集在细胞-细胞粘附、TNF超家族信号通路。而与Bulk CAR-T相比，CD7N CAR-T中高表达的基因（如SOS1, PTPRC, LGALS3）则指向了Src/Ras/Bcl-2通路的广泛激活，这些通路对于T细胞的活化、增殖和抗凋亡至关重要。
通过单细胞测序，研究人员不再是“盲人摸象”般地观察细胞群体的平均行为，而是能够以前所未有的分辨率，精准地“看见”了在CD7N CAR-T细胞中，存在着一群由 AQP3+ 增殖性CD4+ T细胞主导的、具有独特转录组特征的细胞亚群。这群细胞通过高表达SOS1和KLF2，巧妙地平衡了强大的增殖能力、抗凋亡能力和抵抗耗竭的特性，从而解释了为何CD7N CAR-T细胞在体内外能展现出如此卓越的抗肿瘤效果和持久性。这一发现不仅揭示了该创新CAR-T疗法的作用机制，也为未来进一步优化CAR-T细胞产品提供了全新的分子靶点和研究方向。
这项研究通过巧妙的工程化设计，系统性地解决了CAR-T疗法在治疗T细胞恶性肿瘤时面临的自相残杀、抗原逃逸和细胞耗竭三大核心挑战，为临床转化奠定了坚实的基础。而单细胞测序技术的应用，则为我们理解这种复杂细胞药物的内在机制打开了一扇窗，让我们能够从最微观的层面见证其功能优势的根源。
云准科技非常荣幸能够以专业的单细胞测序和生物信息分析能力，助力这一重要发现。同时我们也感谢港大老师一直以来的信任与支持！再次祝贺港大团队！
我们期待与更多科研工作者合作，共同探索生命科学的奥秘，推动更多突破性疗法惠及患者。
参考文献：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202521443
文案：靳姣姣
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