10x Genomics单细胞分析揭示胶质母细胞瘤中巨噬细胞的竞争和分化

文章题目：Single-cell profiling of myeloid cells in  glioblastoma across species and disease  stage reveals macrophage competition and  specialization

发表日期：2021年3月29日

发表期刊：Nature neuroscience

影响因子：20.071

  研究背景  

胶质母细胞瘤(GBM)是原发脑肿瘤中侵袭性最强的肿瘤类型，对免疫治疗有耐药性，胶质母细胞瘤的治疗的效果比较差，由于胶质瘤的异质性太强，疾病的发生发展过于复杂。作为调控免疫系统的树突细胞(DC)和深度参与肿瘤形成的巨噬细胞(TAM)，其在胶质瘤中的作用尚不清楚，所以本研究采用了单细胞测序技术，发现在胶质母细胞瘤的不同阶段以及复发过程中，髓系细胞的特异性变化。这一研究有助于进一步了解发病机制并且揭示了新的药物作用靶点。

  方法流程  

文章共采用了13名GMB患者的肿瘤组织(5名复发患者，8名初治患者)和多个小鼠模型，对髓系细胞在GMB中的作用进行了探索。作者应用scRNA-seq、CITE-seq技术，结合免疫组化等实验，证实了TAM促进GMB形成的作用，并且验证了新型靶向药物的前景。

  研究结果  

01 scRNA-seq分析揭示了人类和小鼠GBM免疫图谱

本研究首先是对比初治患者和复发患者的宏观的单细胞测序结果，并且进行细胞分类，发现胶质母细胞瘤肿瘤细胞的构成都是以肿瘤相关巨噬细胞(TAM)为主，并且发现初治患者和复发患者在TAM1和TAM2的含量上存在差异，初治患者以TAM1为主，复发患者以TAM2为主。为了进一步研究这些细胞和基因印记在发病机制中的作用，作者对比了胶质母细胞瘤小鼠的细胞基因测序结果，发现具有高度一致性。从而可以用小鼠的细胞来进一步阐述人类胶质母细胞瘤的机制。

人类和小鼠TAM细胞图谱

02 单细胞测序对人类和小鼠中不同的cDC2亚群的鉴定

接下来作者对DC进行了研究，发现在人类肿瘤中，DC可以被大致分为8个亚群。在小鼠模型中，也可以找到大致相同的亚群，只是各个亚群中的细胞含量与人类有所不同，其表达的基因也稍有差异，但都可以找到DC1和DC2亚群。通过研究发现，人类和小鼠的cDC都表达了细胞周期相关基因。并且在小鼠中证实，cDC可在肿瘤内进行增殖。

人和小鼠样本中不同的cDC2亚群的鉴定

03 人和小鼠中TAM来源分析

本文对TAM的来源进行了研究，通过基因对比，发现TAM的主要来源有2种，TAM1主要来源于单核细胞，TAM2主要来源于小胶质细胞。通过对比初治和复发患者，发现小胶质细胞来源的TAM是初治患者TAM的主要成分，而复发患者中的TAM更多来自于单核细胞，而在小鼠中，发现TAM主要是来源于单核细胞。因为CCR2是单核细胞重要的趋化因子，在小鼠模型中敲除了CCR2以后，可以发现单核细胞来源的TAM数量明显减少，也再次证明了小鼠中TAM主要是来源于单核细胞。又通过单核细胞的移植实验，证明了TAM是来自于存在于循环系统中并且可以在炎症反应中有趋化效果的单核细胞。通过免疫组化研究，在肿瘤的全部区域中都可以发现两种来源不同的TAM。

聚类分析及免疫组化实验结果

04 Mo-TAMs聚类分析

对于单核细胞来源的TAM进一步基因分析显示，在初治和复发患者中，Mo-TAMs可以大致分为6个主要的亚群。这6个亚群在初治和复发患者中都能发现，但通过对比可以看出SEPP1在复发患者的巨噬细胞中高表达。在小鼠中，6种亚型的巨噬细胞都有分布，并且找到了与人类TAM亚型相似的亚群，为之后进行体外研究提供了理论基础。

聚类分析结果

接下来作者研究了Mg-TAMs的基因表达情况，通过在小鼠模型上研究，发现Mg-TAMs在胶质母细胞瘤的进展过程中，TAM过表达疾病相关的小胶质细胞的相关基因。结果显示，相比于Mg-TAMs，Mo-TAMs表达更多的缺氧相关基因，证明在相对缺氧的肿瘤环境中，TAM主要是来自于单核细胞的。

Mo-TAM和Mg-TAM的表达差异

05 转录状态的变化

文章着重对比初治和复发患者中TAM基因表达的异同，发现在复发患者中单核细胞趋化因子，IFN通路，吞噬作用相关的基因得到了更多表达。而在初治患者中，TAM高表达激素治疗相关的基因。值得注意的是，这些基因的表达在复发患者和初治患者中也体现了异质性。通过统计学方法，发现以下4个基因的高表达和患者降低生存率相关性较高：IL1B，CXCL8，IL6和SPP1。

差异基因的表达

06 CITE-seq分析在蛋白水平上验证了TAM和DC亚群

文章对以上研究的基因表达蛋白进行了验证。通过研究表明，大多数在基因层面的观察结果，在蛋白表达层面都得到了验证。但也有一些在基因层面未显示明显差异，但在蛋白表达层面出现差异。本研究发现了一些在不同发育阶段的TAM和DC细胞，用于以后进一步机制研究。

蛋白水平验证实验

07 Mo-TAMs和Mg-TAMs的体外功能分析揭示了血管生成和T细胞抑制能力

本文进一步验证了单核细胞来源和小胶质细胞来源的TAM功能差异。通过体外培养发现，小胶质细胞来源的TAM有更强的分泌TNF, CCL4和CCL2的能力。这两种来源的TAM都表达了明显高于正常小胶质细胞的促进血管再生能力。并且都没有抗原提呈能力，不能介导T细胞分化但是可以抑制T细胞增殖。所以TAM通过促进血管再生，促进肿瘤增殖，抑制T细胞抗肿瘤作用从而参与肿瘤病理形成。

Mo-tAMs和Mg-tAMs的功能分析

08 基于单细胞测序的结果提出新的治疗靶点

首先通过动物实验证明，减少单核细胞流动只能减少单核细胞来源的TAM数量，但不能减少总TAM数量，这可能是因为小胶质细胞来源的TAM在肿瘤附近增殖的结果。同时，通过PLX3397药物抑制小鼠CSF1R表达，发现小鼠体内TAM含量明显下降，但是单核细胞的流动没有受阻，所以提示阻止了单核细胞向TAM转变。并且发现PLX3397药物处理过的小鼠肿瘤明显缩小，除了说明CSF1R靶点的有效性，也再次说明了TAM对于促进肿瘤生成的作用。

TAM亚群和经典单核细胞的占比

  结论  

胶质母细胞瘤微环境复杂，缺乏有效性靶点，异质性高，对化疗的效果差并且复发率高。本研究通过单细胞测序，揭示了胶质母细胞瘤的髓系图谱，为将来的治疗干预提供了框架。

该研究证明了小鼠模型可以很好的复制人类肿瘤的肿瘤微环境，为动物实验提供理论基础。从基因，蛋白和生物功能3个水平验证了TAM的作用，从体外实验和小鼠研究中找到了一个可以潜在通过抑制TAM而达到抑制肿瘤发展的新靶点。