哎呀妈呀！原来发篇单细胞文章并不难呀！感觉我也可以的！

文章摘要

人视网膜色素上皮细胞（hRPE）排列成单层，在视网膜中起重要的支持作用。目前，尽管已经充分研究了特定视网膜细胞的异质性，但关于 hRPE 细胞的多样性尚未报道。在这里，研究人员对来自三个供体的 9,302 个 hRPE 细胞进行了10x Genomics单细胞 RNA 测序，绘制了人视网膜色素上皮单细胞转录组图谱。研究结果确定了两个在基因表达模式和功能上表现出显着差异的亚群。其中一个细胞亚群特异性表达 ID3，一种黄斑视网膜色素上皮标记物。另一个细胞亚群高表达 CRYAB，一种外周 RPE 标记。研究结果还表明，与氧化应激和内质网应激相关的基因在黄斑 RPE 中更为丰富。与光感、氧化应激和脂质代谢相关的基因在外周RPE中更为丰富。此外，本研究提供了 hRPE 中疾病相关基因的图谱，并强调了黄斑 RPE 和外周 RPE 细胞簇 P4 和 P6 作为视网膜疾病潜在治疗靶点的重要性。本研究为人类视网膜色素上皮提供了一个单细胞转录组图谱，这对于理解视网膜生物学和疾病至关重要。

实验材料与方法

实验材料：从三名捐赠者（年龄29-64岁）中获得三只成人眼睛的人视网膜色素上皮细胞（hRPE）样本

实验方法：10x Genomics单细胞转录组测序

实验内容

1.单细胞捕获，测序，质控

三个样本最终经过单细胞捕获，测序，质控，获得9302个细胞用于后续分析

2.细胞聚类

经过细胞聚类，9302个细胞可以初步分为两个亚群，hRPE黄斑区（439个细胞），hRPF外周区（8863个细胞）。两个亚群在基因表达方面有很大的不同（三个样本结果相似），随后对这些基因进行Gene Ontology (GO)通路富集分析发现，外周RPE细胞和黄斑RPE细胞在质子跨膜转运、内质网应激和ATP代谢过程中可能存在显著差异。

图1 hRPE的单细胞RNA-seq转录组分析

3.亚细胞再聚类，差异基因分析，GO通路富集

对hRPE黄斑区（439个细胞）进行聚类分析发现，根据基因表达谱可将黄斑RPE细胞分为两个亚群（M1和M2簇），进一步GO分析表明，M1簇富含细胞粘附和细胞连接，M2簇主要富含疾病或创伤引起的氧化应激和内质网应激。

图2 黄斑RPE的单细胞RNA-seq转录组分析

当然，作者也进一步分析了外周RPE细胞群。根据基因表达差异，外周RPE细胞可分为8个亚群。GO富集分析显示，8个亚群功能各异。这也是首个人类视网膜外周RPE细胞的转录组分析。

此外，作者通过差异基因分析发现，外周RPE中CRYAB的表达具有更强的特异性，并通过RT-PCR得到验证，因此CRYAB可作为外周RPE的新标记基因。

图3 外周RPE的单细胞RNA-seq转录组分析

4.转录调控因子分析

转录因子是RPE发育所必需的，本研究分析了每个细胞中基因调控网络的活动。检测转录因子活性的结果表明，黄斑RPE与外周RPE中转录因子具有高度活性。大多数转录因子活跃在黄斑RPE，提示黄斑RPE在视网膜发育过程中可能在RPE细胞的分化中起重要作用。

图4 黄斑RPE和外周RPE之间的不同基因表达模式

5.拟时序分析

接下来，作者研究了外周RPE和黄斑RPE细胞亚群的转录组动力学，绘制出发育轨迹。在黄斑RPE亚细胞群中，M1簇细胞处于发育早期，M2簇细胞处于发育晚期。在外周RPE亚细胞群中，细分的亚簇具有特定的发育顺序。进一步的研究还发现，黄斑RPE和外周RPE的特异转录因子的表达，包括IRX3、TWIST1、FOXP1、KLF2、PBX1和NFIB，沿伪时间轴发生变化。

图5 人类外周RPE和黄斑RPE的发育

6.人类视网膜疾病相关基因在各细胞群中的表达差异分析

本研究使用RetNet数据库（https://sph.uth.edu/retnet/）识别与视网膜疾病相关的基因，并确定了这些基因在本研究中的数据中的聚类分布。作者发现一些已知的与视网膜疾病相关的基因在不同细胞簇中分别高表达。

图6黄斑和外周细胞类型中疾病相关基因的聚集表达

讲到这里，这篇文章的研究内容就结束了。整篇文章，只做了三个样本，和细胞聚类，差异基因分析，GO分析，拟时序分析等一些常规的分析。最后，六分的文章就到手了。希望本文的研究思路能为您的研究带来启发。