8色多重荧光免疫组化方法揭示补体在早期类风湿关节炎发展中的作用

来自美国科罗拉多大学安舒茨医学院、英国威廉哈维研究所实验医学和风湿病学中心、伦敦玛丽女王大学伦敦医学和牙科学院和卡迪夫大学医学院的研究人员，为了探索特定补体因子在早期类风湿关节炎中的作用机制及其临床应用可能性，对于PEAC（早期关节炎病理研究项目）的样本进行了研究。

这项研究主要（1）检测了补体激活途径、受体和调节基因的表达，以及它们与滑膜和血液中 DAS28-ESR（关节疾病活动评分）临床疾病严重程度 的相关性的研究。（2）使用Akoya Biosciences PhenoImager 8色多重荧光免疫组化方案，检测了滑膜中关键蛋白的局部表达和病理生理变化，揭示了可能促进局部补体激活的激活和抑制因子的区域改变的重要证据。

表 I. 分析补体和 FcgR 基因在PEAC研究项目样本血液和滑膜粘液中的表达水平

研究发现作为临床疾病活动量度的 DAS28-ESR 与补体基因 mRNA 表达的一个子集，特别是与属于补体系统的所有三个途径的激活途径因子之间存在强相关性。重要的是，补体基因 mRNA 表达与 DAS28-ESR 之间的相关性也仅在滑膜局部发现，而不在外周血中发现，强调了局部补体激活和效应器功能的重要性。

此外，滑膜 CFH 和 MCP (CD46) 基因表达与临床活性之间的负相关表明存在不足水平的调节蛋白来控制强大的补体激活因子。这些发现表明补体系统与滑膜炎症和组织损伤在致病上相关。

图 2. 相关性/气泡图显示治疗后 48 种补体和 FcgR 基因的滑膜和血液基因表达，以及通过 DAS28-ESR 测量的基线和 6 个月时疾病活动度变化的相关性。

使用早期 RA 活检样本进行组织病理学和免疫组织化学研究以优化补体蛋白的检测。通过H&E和免疫组化IHC, 确认滑膜活检中存在七种补体蛋白和复合物，即 C3c、CFHR4、CFB、CFH、FCN3、MBL2 和 C5b-9 (MAC), 证实在 mRNA 分析中鉴定的个体补体蛋白确实在早期 RA 患者的滑膜中表达，因此可能在关节局部在关节炎和组织损伤的发展中发挥作用。

图 3.  七 种补体蛋白的早期 RA 滑膜活检样本的H&E、免疫组织化学 (IHC) 染色结果，黑色箭头表示每种补体蛋白的阳性棕色染色。

图 4. 早期 RA 患者滑膜活检样本中补体蛋白阳性细胞定量分析

为了进一步证实补体基因及其各自蛋白质表达之间的相互关系，对早期 RA 患者滑膜活检样本中的C3c、CFHR4、CFB、CFH、FCN3、MBL2 和 C5b-9 (MAC)，七种补体蛋白进行多重荧光免疫组化染色（mIHC），并对这些蛋白的整体分布及相互关系进行了分析。每种蛋白表达量进行定量分析。滑膜中的大量细胞分别是 CFH1，其次是 C3c1/CFB-/CFH- 和 C3c1/CFB-/CFH1。这种重叠的补体蛋白表达分析表明滑膜细胞在直接参与调节 AP 的早期 RA 活检中也表达了一种以上的补体蛋白。

图 5. 早期 RA 患者滑膜活检样本中7种补体蛋白的8色多重免疫荧光染色及其单个补体IHC染色结果图像。C3c-红色，CFB-粉红色，CFH-青色， CFHR4-洋红色，MBL2-绿色，FCN3-白色，C5b-9 (MAC)-黄色，DAPI-蓝色。  (A) 显著表达C3c 的样本 (B)同时检测到7种补体的样本。

多重免疫荧光图像显示，活检亚结构域中存在的另一个特征是 C3c 相对于 CFH 蛋白缺乏一致的表达。在一些活检中，CFH 明显存在于滑膜中，完全没有 C3c。相比之下，在早期 RA 滑膜的其他区域，CFH 和 C3c 完全分离，反映了局部激活与调节的潜在不平衡。值得注意的是，脂肪细胞之间的间隙中有更多的 C3c 沉积，而在血管周围有更多的 CFH 沉积。分别在滑膜下衬里区域和深滑膜下衬里区域观察到 CFH 和 CFB 的明显划分以及 C3c 共定位。

图 6. 具有代表性的多重免疫荧光结果显示早期 RA 活检中滑膜和滑膜下区域存在免疫细胞和补体蛋白的区域失衡。CFH-青色、C3c-红色、CFHR4-紫色、CFB-粉色、FCN3-白色、C5b-9(MAC)-黄色。

分别量化了滑膜和滑膜下衬里区域中补体蛋白的存在。与滑膜衬里相比，滑膜下衬里区域的 FCN3、MBL2 和 MAC 呈增加趋势，但并不显著。总之，维持激活（即 C3c 和 CFB）和调节（即 CFH）之间的一般关系，促进对 CS 的整体控制。然而，如图 7 所示，这些区域中有许多单独的区域表现出显著差异，这表明存在依赖于上下文的激活位点。这种非常局部的激活和调节蛋白失衡表明，失调可能在滑膜组织内某些区域对补体激活刺激的反应和效应分子的产生中发挥特别重要的作用。

图 7. 使用多色免疫荧光结果，对早期 RA 活检的滑膜和滑膜下衬里区域进行定量补体蛋白分析。

综上，通过滑膜中特定补体基因 mRNA 表达水平与DAS28-ESR的相关性分析，证明了补体系统在早期RA发送过程中起到重要作用，FcgRs 和 C5AR1 组合在一起可能是更有价值和更优越的治疗靶点。早期 RA 滑膜的多重免疫组织化学分析揭示了可能促进局部补体激活的激活和抑制因子的区域改变的重要证据。如果在 RA 的早期阶段选择性地应用，抗 C5AR1 作为精准医学方法的一部分可能是有效的。

参考信息

1. Analysis of Complement Gene Expression, Clinical Associations, and Biodistribution of Complement Proteins in the Synovium of Early Rheumatoid Arthritis Patients Reveals Unique Pathophysiologic Features.J Immunol May 2, 2022, ji2101170.