Nature Medicine再论多重免疫荧光揭示预测性生物标志物，用于优化免疫治疗临床试验设计
免疫检查点抑制剂（ICI）的发展带来了癌症治疗的一场革命。尽管从历史上看，肉瘤是第一种免疫疗法与临床获益相关的肿瘤类型，但这些 ICI 均未获批准用于治疗肉瘤患者。结合多项PD-1/PD-L1 靶向治疗晚期肉瘤研究结果，在未经选择的人群中，临床获益非常有限。
来自法国波尔多大学、尼斯大学医院中心、贝尔戈尼研究所等多家研究机构和Explicyte的学者们联合报告了一项创新的生物标志物驱动的临床试验，该试验使用 TLS 作为生物标志物来选择癌症患者接受 ICI 治疗。富含 TLS 的队列的缓解率和 PFS 均显著高于 PEMBROSARC 研究的先前所有患者队列（分别为 30% 对 2% 和 4.9 对 1.5 个月）。这些结果与此前对 SARC028 研究中肿瘤样本的回顾性分析结果一致，表明晚期软组织肉瘤（STS） 中 TLS 的存在是一种潜在的预测生物标志物，可改善患者对派姆单抗治疗的选择。
在PEMBROSARC 研究的临床试验设计中，研究者基于600 多个 STS样本的转录组数据定义了一个“高免疫”的肉瘤亚组，并使用多色免疫荧光验证样本中的肿瘤内 TLSs的组织特征，增加了一个基于 TLS 是否存在选择的新队列，以研究派姆单抗在晚期肉瘤患者中的疗效，TLS是否可以成有效治疗预测生物标志物。
瀑布图和蜘蛛图显示TLS 阳性肉瘤患者肿瘤大小的变化
在研究 ICI 对肉瘤患者的治疗影响及其与肉瘤微环境的相关性的过程中，研究人员先对肉瘤的免疫景观进行了大规模分析，以确定 TLS 阳性肉瘤对免疫检查点抑制反应的决定因素。使用转录组测试和表达全转录组图谱信息，研究人员分析了多个 STS 样本，确定了 “高免疫”的TLS特征，即 B 细胞相关基因特征的表达升高，这可以独立于 CD8+ T 细胞浸润水平来预测存活率。
使用转录组测序技术分析 TLS 阳性肉瘤对派姆单抗反应的决定因素
使用多重免疫荧光 (mIF) 分析显示，这类“高免疫”肉瘤的特征在于存在肿瘤内 TLSs. 三级淋巴结构（TLS）是 B 细胞滤泡、滤泡树突细胞 (DC) 和 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的异位形成的聚集体，多项研究已证明其和抗癌免疫高度相关。
多重免疫荧光标记MUM1/CD20/CD27/CD3/COL1A1/IgG、CD8/GzmA/CD4/FOXP3/CD56分析TLS特征和生存率间关系
在 TLS 结构之外，治疗应答者和非应答者之间最显著差异表达的基因是那些编码免疫球蛋白，特别是免疫球蛋白 G（IgG）的基因。多色免疫荧光标记肿瘤内的CD83、CD1c、CD11c、CD68、HLA-DRA、DAPI对比应答者和非应答者的TLS，显示非应答者中幼稚 B 细胞的浸润程度更高。
多重免疫荧光验证抗原呈递细胞肿瘤浸润与 TLS 阳性肉瘤患者的抗 PD-1 反应有关
为了可视化应答者和非应答者之间免疫细胞丰度的差异，研究者开发了三个六色免疫荧光方案，能够同时检测（1）细胞毒性 T 细胞（CD8 和自然杀伤细胞）、Treg 细胞（CD8+、GzmA+ 、CD4+、FOXP3+/CD56+)（2） B 细胞、PC 和成纤维细胞（MUM1+、CD20+、CD27+、CD3+、COL1A1+、IgG+）（3）激活、常规 DCs 和巨噬细胞（HLA-DR、CD11c、CD1c、CD68、CD83）。对患者样本分析发现，表达 IgG 的 PC 与患者结果之间的关联表明抗肿瘤抗体的产生，这可能通过 DC 增加抗原呈递来改善 CD8 T 细胞反应。CD11c+/HLA-DR+ DC 丰度的增加与 PFS 和 OS 的改善有关。
综上，PEMBROSARC 研究临床二期采用了生物标志驱动的设计思路，引入了TLS作为预测性生物标志物，以研究派姆单抗在晚期肉瘤患者中的疗效，其结果表明晚期 STS 中 TLS 的存在是一种潜在的预测生物标志物，可改善患者对派姆单抗治疗的选择。在前期生物标志物探索中，研究者结合转录组测序和多重免疫荧光mIF技术，对TLS的特征和预后相关进行了研究和机制探索，发现肿瘤内浆细胞 (PC) 的丰度与改善结果显著相关。
参考文献
1. Pembrolizumab in soft-tissue sarcomas with tertiary lymphoid structures: a phase 2 PEMBROSARC trial cohort. Nature Medicine (2022), 1106.
https://doi.org/10.1038/s41591-022-01821-3
