原位多组学空间表型分析深度解析艾滋病免疫失调机制
艾滋病是一种危害性极大的病毒性传染病，由人免疫缺陷病毒（HIV）引起。一般来说，HIV病毒在感染黏膜组织靶细胞后两周内就会扩散到淋巴器官。进入发病期后，HIV病毒主要通过攻击CD4+T淋巴细胞导致机体丧失免疫功能。感染组织微环境的原位解析能够帮助我们更深入地理解HIV感染如何导致机体免疫失调，但传统手段很难获得感染组织的高参数病理结果，限制了研究的进展。近期，斯坦福大学的Garry Nolan教授研究团队通过蛋白-核酸原位成像法实现了33种生物标志物检测，建立了多组学空间表型分析体系，并在《Immunity》杂志上报道了HIV宿主淋巴组织免疫抑制微环境形成机制的研究成果[1]。
研究背景
艾滋病又叫获得性免疫缺陷综合征（AIDS），于1981年首次发现，是由于感染HIV病毒导致的 CD4+T淋巴细胞减少为代表特征的免疫衰竭综合症[2]。HIV感染后的平均潜伏期为8-10年，患者常于感染后 10-15年因并发各种机会性感染或恶性肿瘤而死亡。
近二十年来，抗逆转录病毒疗法（ART）用于AIDS患者的治疗取得了很好的效果。ART能完全抑制HIV的复制，改善免疫功能并大幅降低AIDS的病发风险。但是，ART不能根治AIDS，临床数据表明，停药后病毒总是可以在几周内“卷土重来”[3]。体内HIV难以清除的主要障碍就是在HIV感染的过程中，病毒能够潜伏在某个亚群的细胞中，形成HIV潜伏病毒库(latent reservoir)。在潜伏病毒库中，HIV通过隐藏在被感染细胞的基因组中逃避宿主免疫系统的监视，等待发病时机的到来。
目前，对于组织中潜伏病毒库的研究手段多限于消化组织并进行单细胞检测，再辅以原位杂交（ISH）和免疫组化。这种检测手段无法深入解读潜伏病毒库及周围细胞亚群的原位空间信息，限制了其研究的发展。这篇题为“Combined protein and nucleic acid imaging reveals virus-dependent B cell and macrophage immunosuppression of tissue microenvironments”的研究中，作者利用原位多组学空间表型分析的手段，实现了低拷贝数病毒核酸和多种蛋白标志物的原位检测，为我们提供了崭新的研究视角。接下来我们就跟着作者的思路，从技术体系搭建和科学问题研究两个方面来解读本文的内容。
研究过程
作者首先面对的关键技术难题就是：如何能在同一张组织切片上同时检测蛋白表位和微弱的病毒核酸（vDNA和vRNA）信号？研究选用了非人灵长类动物疾病模型，分别利用猿猴免疫缺陷病毒（SIV）和新冠病毒（SARS-CoV-2）进行vDNA和vRNA造模。将核酸原位杂交技术（DNA/RNA Scope）与该课题组常用的几种蛋白原位检测技术（IF、Akoya的PhenoImager HT(原Vectra Polaris）、Akoya的PhenoCycler（原CODEX)、MIBI）相结合，在细胞系（图1B）和组织切片（图1D和E）中实现了蛋白-核酸原位成像（简称PANINI）。值得一提的是，在实验体系优化过程中，作者利用pH9抗原修复液有效保留样本ISH敏感性的特点，突破了传统方法样本制备的技术壁垒。成功实现了一个样本中31种蛋白和2种核酸（对vRNA和vDNA单拷贝级别精度）的检测。
图1 蛋白-核酸原位成像技术（PANINI）的建立
接下来，作者在超多标蛋白-核酸原位成像的基础上对样本进行空间表型分析，对比SIV感染组和对照组恒河猴淋巴组织中的细胞表型差异。33种标志物中包含：结构标志物（dsDNA，Histone H3，Pan-Keratin，SMA和Vimentin），核内功能标志物（FoxO1，FoxP3，Ki-67，Lamin AC，NF-κB-p100和Pax-5），细胞质内标志物（IL-10，granzyme B和CD25），髓系细胞功能标志物（CD11b，CD16，CD68，CD163和 DC-SIGN），免疫细胞分群标志物（CD21、CD36、CD45、CD56、CD138、HLA-DR 和 MPO），以及标记感染细胞的vDNA 和 vRNA。根据免疫细胞标志，作者得到样本中14种细胞表型的分析结果（图2）。
图2 空间表型识别结果
在对14种细胞亚群逐一分析的过程中，作者发现通过FOV细胞表型分析无法归纳出病毒感染之后免疫系统的调节规律。
该空间表型分析出场了！作者的应对策略是采用细胞邻域（Cellular Neighborhood，CN）分析，不仅关注细胞本身，还关注该细胞周围的19个细胞（共20个细胞，图3A），并对得到的信息加以k-means聚类分析（不考虑感染指标，图3B），进而得到了11个有着独特细胞分布特征的细胞邻域（CN，图3B）。在CN分类完成的基础上，分析SIV感染导致的CN分布改变以及其中细胞的功能调节。这种细胞群体追踪的方法让作者找到了多个SIV感染后的微环境变化规律。在SIV感染导致的众多CN变化中，作者发现病毒感染导致CN8（富含巨噬细胞和CD8+T细胞）取代CN3（富含巨噬细胞和CD4+T细胞）占据主导地位，同时巨噬细胞免疫抑制功能相关标志物（DC-SIGN，FoxO1，IL-10和CD169）阳性的细胞比例显著升高。
图3 病毒感染后组织微环境内细胞邻域分析
接下来作者做了详细的细胞-细胞分析以及CN-CN分析，对比SIV感染后组织重塑情况（图4），进一步将关注点锁定在富含B细胞的CN2和富含巨噬细胞的CN8上。至此，作者已经找出SIV感染事件中导致免疫失调的关键细胞：病毒依赖性B细胞和免疫抑制型巨噬细胞（详细过程见原文）。
图4 SIV感染后的组织重塑分析
在随后的功能性分析中，作者发现CN2中的B细胞和CN8中的巨噬细胞中IL-10阳性细胞比例显著升高（图5A）。一系列巧妙的实验设计和检测结果表明：SIV感染激活B细胞中FoxO1的表达，产生IL-10促进了巨噬细胞的M2型活化，进而形成免疫抑制微环境。
图5 SIV感染后B细胞来源IL-10产生与巨噬细胞极化和免疫抑制相关
最后，作者还用蛋白-核酸原位成像技术进行了SIV病毒感染后组织特性的分析，找出了感染过程中几个关键的标志物（CD56，IL-10，FoxO1，HLA-DR，CD21等）并提出了相应的原位多组学空间表型分析模型。不得不承认，这篇文章可谓是空间表型分析在艾滋病研究中应用的杰出典范。
参考文献
1.Jiang S, Chan CN, X Rovira-Clavé, et al. Combined protein and nucleic acid imaging reveals virus-dependent B cell and macrophage immunosuppression of tissue microenvironments. 2022, Immunity 55, 1118–1134
2.JUNPO Hiv/Aids. 2006 Report on the Global AIDS Epidemic. Geneva Switzerland Unaids Jun, 2004, 27(7):553-556.
3.Deeks, S., Overbaugh, J., Phillips, A. et al. HIV infection. 2015, Nat Rev Dis Primers 1, 15035.
