肝移植组织微环境研究，多重荧光免疫组化有这些新发现！
排斥反应是影响肝移植术后患者长期生存和预后的主要障碍，到目前为止，在肝脏免疫细胞的确切表型尚未明确。然而，不同表型和分子研究的结果表明，浸润淋巴细胞的组成可能是与排斥反应有关的一个重要因素。肝脏由大约100万个肝小叶组成，血液从周围的肝门静脉区流向中央静脉。通过多重免疫荧光染色，可以同时标记多细胞标记物，观察各种细胞类型、功能状态和相互作用。
首都医科大学附属北京友谊医院肝脏移植中心朱志军教授和孙丽莹教授发表在Inflammation上的“Multiplex Immunofluorescence for Detection of Spatial Distributions of Infiltrating T Cells Within Different Regions of Hepatic Lobules During Liver Transplantation Rejection”，通过多重荧光免疫组化技术阐明了发生排斥反应的移植后肝组织的免疫细胞类型，数量和分布。
研究使用正常肝脏（N），肝移植后未发生排斥反应（NR）的肝脏和发生了排斥反应（R）的肝脏组织；用以下抗体：抗CD4，-CD8，-IL-17和- Foxp3分别进行单色免疫组化和多重荧光免疫组化染色；使用PhenoImager HT（原Vectra Polaris）进行拍摄。
排斥反应组的组织病理学特征包括三种主要的病变:肝门管炎、胆管损伤和内皮炎。HE染色显示排斥反应组肝肝门区及肝小叶免疫细胞浸润明显增加。CD4主要表达于肝窦内皮细胞、Kupffer细胞和T细胞。排斥反应组细胞浸润性免疫细胞和CD4+ T细胞明显增多，CD4+肝窦内皮细胞和Kupffer细胞减少；正常肝组织中较少存在CD8+ T细胞，而排斥反应组的CD8+ T细胞数量增多。IL-17主要表达于肝细胞、内皮细胞和免疫细胞细胞质中。排斥反应组淋巴细胞中IL-17表达较正常组和非排斥反应组增高。FOXP3主要表达于细胞核和免疫细胞。FOXP3+ T细胞在正常肝组织中几乎不存在。排斥组的FOXP3+ T细胞明显多于非排斥组。
由CD4、CD8、IL-17和FOXP3抗体组成的的多重免疫荧光检测被用作观察与肝排斥有关的免疫浸润成分变化的一种手段。结果显示，CD4+ T、CD8+ T、Treg和Th17细胞在肝移植后的排斥反应组和非排斥组中所占比例均增加，提示这些细胞参与了肝移植后排斥反应或免疫耐受的形成。浸润型FoxP3+ Treg细胞(CD4+FOXP3+ T和 CD8+FOXP3+ T 细胞)在排斥组明显增多；CD4+IL-17+ T (Th17) 和 CD8+IL-17+ T 细胞也增多。
肝小叶和肝门脉区的组织结构有较大差异，通过多重染色技术，我们观察到T细胞在肝小叶分布的差异，并总结了不同肝移植免疫状态下T 细胞在肝脏内的空间分布不同。在这两个区域中，非排斥组的Treg 和 Th17非常少见，浸润性T细胞主要集中在肝门脉区，浸润肝小叶的较少。
肝小叶可划分为静脉周围区、过渡区和肝门脉周围区。其中排斥组Treg细胞比例明显高于其他两个组，在两个移植组均发现了CD4+和CD8+T细胞比例高于正常组，其中排斥组这两种细胞的比例更高。在过渡区，排斥组CD4+ T和Treg细胞比例明显高于其他两组。在静脉周围区，排斥反应组CD4+ T、CD8+ T、Treg细胞比例较其他两组明显升高。作者还观察到同一组肝组织不同区域T细胞空间分布的差异。
对比HE染色和传统免疫组化技术，多重荧光免疫组化技术不仅可以在一个组织上同时标记多种蛋白。而且通过多种细胞标记，可以更详细划分细胞亚型，了解细胞与细胞之间的位置关系，并且可以更准确地进行组织区域划分。通过多重荧光免疫组化技术，可以帮助我们更好得了解移植组织的免疫微环境状态，研究移植组织排斥发生的免疫细胞变化和可能原因。
参考文献
1. Multiplex Immunofluorescence for Detection of Spatial Distributions of Infiltrating T Cells Within Different Regions of Hepatic Lobules During Liver Transplantation Rejection. Inflammation. Volume 45, pages 651–664 (2022)
