PhenoImager多重荧光免疫组化技术应用于COVID19研究再添新成果， 揭示COVID-19重症患者支气管组织损伤机制

中性粒细胞（Neutrophils，也叫多形核嗜中性粒细胞）是人体循环系统中数量最多的白细胞，是血液中主要的吞噬细胞。这类细胞主要来源于骨髓，因其分化成熟后具有分叶状细胞核，并且胞浆内含有大量pH中性的溶酶体颗粒而得名。中性粒细胞不仅在天然免疫中发挥重要作用，也能参与调节获得性免疫反应。

在病理条件下，中性粒细胞被激活并进行跨血管迁移进入到组织中行使病原体清除的职责。在病原体清除过程中，中性粒细胞有两种主要的“工作手段”，一种是较为经典的方式：通过直接吞噬病原体的方式将其清除；另一种是近年来发现的新方式：中性粒细胞在应激条件下能释放一种被称为NETs（Neutrophil Extracellular Traps，中性粒细胞胞外诱捕网）的网状复合体，在自身体积10-15倍的范围内将病原体捕获并杀死。中性粒细胞分泌NETs的过程被称为“NETosis”，即中性粒细胞的炎性细胞死亡方式。由于NETs中含有染色质和胞浆颗粒源性蛋白（过氧化酶、抗菌肽等），在杀伤病原体的同时会造成不同程度的组织损伤。

已有研究证实COVID-19患者症状的严重程度与肺组织中的髓系细胞（单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等）的募集量有关，但中性粒细胞在COVID-19病理过程中发挥的作用尚不明确。以往的研究表明，在新冠肺炎尸检样本中，肺泡组织损伤区域中有大量的中性粒细胞募集[2]。本文的作者从“中性粒细胞是否与COVID-19重症患者肺组织损伤有关？”这个问题出发开始了他们的研究。

作者首先采用PhenoImager多重荧光免疫组化技术建立了COVID-19尸检样本组织微环境检测体系，在分析样本中性粒细胞（CD66b和CD15）浸润的同时分析NETs的空间分布情况（通过标记髓系过氧化物酶体MPO、组蛋白H3瓜氨酸R2+R8+R17信号H3Cit与CD15的三阳性区域）。

作者通过对比组织全玻片扫描结果中每一个视野下各种细胞的比例，发现释放NETs的中性粒细胞主要分布在肺间质区中围绕角蛋白支气管上皮细胞的区域（图1A）。另外，作者发现NETosis现象在细菌性肺炎和COVID-19尸检样本肺组织中常见，在其他几种肺炎中并未检测到（图1和原文补充材料）。通过对孕妇外周血和新生儿脐带血中的IgM和IgG的检测，发现感染新冠的孕妇的IgM和IgG水平有很大差异，而脐带血抗体检测结果显示没有新生儿感染了新冠病毒。

由于新冠病毒感染可能引起细胞因子风暴，所以研究者还检测了孕妇和新生儿的细胞因子水平。结果显示孕妇和新生儿的细胞因子水平均有上升。通过ROS实验和流式细胞术发现，感染新冠病毒的孕妇外周血中的T细胞数量减少。

接下来，作者通过转录和蛋白水平检测（SARS-CoV-2 N蛋白）分析COVID-19患者肺组织中NETosis与病毒载量的相关性。结果表明，肺组织中NETs区域与组织中病毒载量并无相关性（详见原文）。因为机体中多种炎症介质（如TNF-α，IL-8，IL-1β，C5a和IL-17A）能诱发中性粒细胞的NETosis，所以作者设计了一系列实验检测多种细胞因子与肺组织NETs密度的相关性。RNAscope结果显示，IL-8 mRNA在一些细支气管上皮细胞、内皮细胞和其他细胞（巨噬细胞、中性粒细胞等）中表达量较高（图2 A-B，原文补充材料）。

另外，作者发现IL-8 mRNA表达水平与肺组织内NETs密度有较高的相关性（rs= 0.708;P = .002）（图2C）。因此，在COVID-19患者肺组织中IL-8（又称CXCL8，可招募中性粒细胞）的表达升高导致组织内中性粒细胞募集量增加，同时诱发被招募的中性粒细胞通过NETosis在肺组织内释放NETs。