Nat Commun | 仁济医院与中科院巴斯德所合作，利用单细胞测序 多色流式 多重免疫荧光方法揭示严重风湿免疫疾病发病机理
研究背景
特发性炎症性肌病(idiopathic cinflammatory myopathies，IIM)是一组系统性自身免疫性结缔组织病，基于临床及免疫病理特点主要分为多发性肌炎(polymyositis，PM)、皮肌炎(dermatomyositis，DM)和包涵体肌炎(inclusion body myositis，IBM)3种亚型。可能与感染（如病毒、弓形体等）、遗传因素及免疫功能异常等有关。特发性炎症性肌病的病理特点是肌组织内炎症细胞浸润，以T淋巴细胞为主，但也可有巨噬细胞、浆细胞，有时嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和中性粒细胞也可以出现。在PM中典型的浸润细胞为CD8+T淋巴细胞，聚集于肌纤维周围的肌内膜区，而在DM主要是CD4+T淋巴细胞浸润肌束和小血管周围的肌外膜区，肌束周围的萎缩更常见于DM，而坏死性血管炎不常见。
MDA5+DM是特发性炎症性肌病中的一种特殊类型，极易并发快速进展性间质性肺病（RPILD），约40%患者在起病1年内死亡。该病的核心致病机制目前尚不清楚，也缺乏特异有效的治疗手段，是当前风湿病领域临床和基础研究的热点和难点。
研究方法
在本研究中，研究人员通过单细胞测序技术分析了MDA5+DM患者外周血和肺组织的免疫学特征，重点分析了适应性免疫相关的T、B淋巴细胞的基因表达谱和受体库特征，并且用多色流式细胞术和多重免疫荧光进行了验证。
研究结果
1. 单细胞测序发现MDA5+ DM-Act患者免疫系统的特殊性
研究纳入7例病情活动期的MDA5+ DM（MDA5+ DM-Act）患者，3例MDA5+ DM缓解（MDA5+ DM-Rem）患者，用5例特发性炎性肌病（IIM）患者和4个健康捐献者作为对照，对他们的外周血B细胞和T细胞进行scRNA-seq。结果发现，在MDA5+ DM-Act 组中ISG+ B 细胞， CD4+T细胞和CD8+ T细胞的形成的簇明显大于其他三组，这预示着MDA5+ DM-Act患者的获得性免疫系统有独特的激活状态。
研究人员继续对四个组中的外周血B细胞亚型划分进行详细研究。结果发现，在MDA5+ DM-Act患者中，ASC（抗体分泌细胞）的终末分化极大地激活了B细胞的分型。然后，研究人员进行了scBCR-seq来评估B细胞的响应情况。发现MDA5+ DM-Act患者组的前20种克隆型中，ASC的出现频率高于其他组，而且其自身抗原驱动的抗体反应非常强烈。
2.单细胞测序+多重免疫荧光发现与MDA5+ DM-Act患者免疫系统特殊性相关的信号通路
研究人员继续研究其CD4+T细胞与CD8+T细胞的分型情况。发现在MDA5+DM患者组中，Ki67+CD8+细胞数量更少。通过scTCR-seq检测TCR状态，发现在MDA5+ DM-Act组患者的Tm细胞亚型间是高度关联的。并且，在MDA5+ DM-Act组患者中CD8+ T细胞高度激活并克隆性扩增，这种现象保持到了MDA5+ DM缓解的患者中。随后，研究人员对外周血B细胞和T细胞的分子特征进行深入研究，生成表达差异最大的15个基因的热图，发现type I IFN信号通路在MDA5+ DM-Act组患者中高度激活。
在该研究中还开发出一种sc-Metabolism单细胞代谢组分析方法，用来研究外周血B细胞和CD4+与CD8+T细胞的代谢通路图谱。结果发现在MDA5+ DM-Act患者中发现了高度代谢激活状态，并且反映出这种压力状态与不正常的type I IFN信号高表达有关。
随后，研究人员对一例MDA5+ DM患者的肺组织进行scRNA-seq，与对照组相比，MDA5+ DM的肺组织中有更多的的ISG+CD4+ T 细胞，ISG+CD8+ T细胞和CD8增殖细胞。对另一个MDA5+ DM患者的肺组织穿刺后进行多重免疫荧光实验，发现与健康对照组相比，MDA5+ DM患者的肺组织中有大量免疫细胞浸润和三级淋巴结构，并且检测到了更多的Ki67+CD8+ T 细胞与 MX1+CD8+ T细胞。结合scRNA-seq结果与多重免疫荧光结果，预示着随着type I IFN通路在MDA5+ DM患者中的强激活，肺组织中产生了强大的获得性免疫反应。
3.基于MDA5+DM患者表达特征探索预后标记物与有效治疗方案
由于在MDA5+DM患者中 type I IFN信号通路的系统性激活，为这个疾病的潜在生物标记物和可能治疗方案提供了方向。
研究者通过流式细胞技术检测ISG15+ 和MX1+ B 细胞, CD4+和CD8+ T 细胞。发现与两个对照组相比，MDA5+ DM-Act组中这些细胞的频率增加，MDA5+ DM-Rem组中出现频率降低。多变量分析发现ISG15+%CD8+ T细胞与铁蛋白是该疾病的独立预测标记物，并且ISG15+%CD8+ T作为标记物在一年生存期的预测中展现出非常高的AUC值。
最后，研究人员还进行了治疗有效性临床试验，比较活跃期的MDA5+ DM患者单独使用CNI（免疫抑制剂）与联合使用CNI+托法替尼（JAK抑制剂）的治疗效果。联合使用组展现出了更多的临床获益。
结论
在这项研究中，研究者应用单细胞测序联合多重免疫荧光及流式细胞术，发现了病情活动的MDA5+DM患者外周血中浆细胞（又称为抗体分泌细胞ASC）和增殖性CD8+T细胞的比例较对照组明显增加，表明该疾病中适应性免疫系统被显著激活。
此外，I型干扰素信号通路在患者外周血和肺组织中都存在过度活化，特别是表达干扰素诱导基因ISG15的CD8+T细胞比例与疾病的不良预后密切相关。基于上述MDA5+DM相关的关键细胞和通路，研究者提出对患者进行个性化检测和治疗的新策略，根据T、B细胞及I型干扰素信号通路的活化情况评估患者免疫状况，联合使用对干扰素通路和B细胞分化具有靶向抑制作用的JAK抑制剂（JAKi）和靶向T细胞的钙调磷酸酶抑制剂（CNI），或可有助于提高治疗疗效，改善患者生存率。
参考文献
1. Single-cell profiling reveals distinct adaptive immune hallmarks in MDA5+ dermatomyositis with therapeutic implications. Nature Communications, vol 13, Article number: 6458 (2022)
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