Cell Stem Cell | ISH、mIHC、scRNA-seq多技术确定“干细胞指数”——结肠癌化疗响应潜在评估指标
恶性肿瘤细胞具有高度异质性（Heterogeneity）和可塑性（Plasticity）。在肿瘤组织中，有一小部分比例相对稳定并具有增殖和肿瘤重建能力的肿瘤干细胞（Cancer stem cell）。这类细胞通常处于相对静止的细胞周期，对放疗和化疗不敏感，但在特定的刺激条件下，能重启细胞周期并开始快速增殖。因此，肿瘤干细胞是导致肿瘤化疗药物耐受的重要原因之一。研究表明，增强干细胞可塑性能提高肿瘤细胞对环境压力的选择适应性。然而，干细胞可塑性尚没有临床可用的检测指标。近日，来自牛津大学的Simon J. Leedham博士和他的研究团队在《Cell Stem Cell》(影响因子:25.269）杂志上提出了可用于结肠癌临床响应程度评估的潜在指标——”干细胞指数“[1]。
研究背景
成体干细胞（Adult Stem Cells）是一类在已分化组织与器官中具有自我更新和多向分化潜能的尚未分化的不成熟细胞群体。在肠道组织中，成体干细胞（肠道干细胞）发挥着自我更新、补充新生细胞和组织损伤修复等作用。生理状态下，肠道干细胞位于肠黏膜隐窝基底部，会随着组织更新需求不断向隐窝顶部（肠腔方向）迁移同时分化成为不同的肠黏膜组织细胞。
最早在人和小鼠体内发现的肠道干细胞标志分子是LGR5（Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5，又名GPR49）[2]。LGR5阳性的隐窝基底柱状细胞（Crypt-base columnar cells，CBC）通过和肠黏膜隐窝基底部的Paneth细胞接触从而维持干细胞特性（没接触的细胞则在分裂完成后继续分化）。另外，肠道组织中还有一类细胞在受到如损伤等刺激的条件下通过YAP信号通路，激活Ly6a（Sca1），Anxa1和Clu表达，退分化形成再生干细胞（Regenerative stem cells，RSC），进而作为组织修复的快速响应者发挥损伤修复作用。
在肠道肿瘤组织中，CBC和RSC两种干细胞仍旧存在并发挥重要作用。2009年的一篇研究指出，Lgr5+ve CBC中Apc基因的失活是结肠组织癌变过程中的关键事件[3]，提示CBC是肠道肿瘤发生的起源细胞。随后，几篇报道相继证实结肠肿瘤组织中还存在具有干细胞特性并能促进远端转移的Lgr5-ve RSC[4, 5]。直到近期，人们发现Lgr5+ve和Lgr5-ve这两种肿瘤细胞可以在组织微环境中信号转导相关因子的调控下进行相互转换[6]。这就提示两种肿瘤干细胞之间的动态变化可能与结肠癌病理进程相关。这项研究的作者们就从这个关注点出发开始了他们的研究。
研究过程
首要面对的难题就是：如何能在异质性肿瘤组织中将两种不同的干细胞准确地检测出来？
作者利用RNA原位杂交（ISH）、多重荧光免疫组化（mIHC）和scRNA-seq技术，通过分子及形态学特征来鉴定肠道组织中的成体干细胞群。采用公认的LGR5（CBC标志）和ANXA1（RSC标志）作为标志物分别标记CBC和RSC两种干细胞，以常规免疫细胞和间质细胞的标志物作为肠组织结构参照（图1A），在人和小鼠样本中检测。结果表明，LGR5的表达仅局限于隐窝基部的上皮细胞中，检测起来比较轻松（图1A和B）。相比之下，ANXA1的检测难度要大得多，在正常生理状态下，肠道上皮细胞中很难检测到ANXA1的表达（图1A和C）。令人欣慰的是，在肿瘤样本中，ANXA1在上皮细胞中的表达强度升高，可以比较容易地被检测到（图1B）。不仅如此，作者还发现，在肿瘤组织中，肿瘤干细胞很少共表达LGR5和ANXA1两种标志物，表现为不同程度的偏向于CBC或RSC表型（图1C）。这种分化倾向性提示我们CBC-RSC的动态变化可以作为结肠癌微环境状态的指示参数。
图1 CSC和RSC的分子和形态学评估
接下来，作者通过对多组人和小鼠结肠癌样本的数据分析发现了能表征结肠癌组织中CBC-RSC动态变化的参数——干细胞指数（Stem cell index）。简单来说，作者所用的方法是：利用基因集变异分析（GSVA）在样本scRNA-seq数据中计算单个样本中RSC和CBC两种细胞的富集评分，再从RSC分值中扣除CBC分值就算出了用于分析肠道干细胞相对丰度的“干细胞指数”。
随后作者利用干细胞指数（配合病理检测）对比分析了肠道息肉和结肠癌组织（包括单基因病变样本），结果表明，两种肿瘤干细胞在不同病理分型的样本中有不同的富集倾向：CBC倾向在经典通路发生突变的患者中富集（如管状腺瘤、CMS2 和 CRIS-C、D、E 亚型）；RSC则倾向于在诸如锯齿状前体病变和肿瘤分子亚型为CMS4和CRIS-B病理的样本中富集（图3）。不仅如此，作者还发现了适用于小鼠样本的干细胞指数分析方法，并实现了对Apc突变样本（CBC富集）和部分其他基因突变样本（Kras、Braf或Tgfβ突变，RSC富集）的分型检测。随后，作者还证实了结肠癌组织中肿瘤干细胞富集倾向和基因突变之间的相关性（详见原文）。
图2 干细胞指数在人类结肠癌样本中的应用
为了进一步明确结肠癌微环境对CBC-RSC动态富集是否存在调节作用，作者用多重荧光免疫组化检测并量化分析了几种不同基因型小鼠结肠癌样本中的免疫细胞、间质细胞和细胞间质成分（图3A和B）。并通过在类器官模型中对IFN-γ和TGFβ进行了补充实验来模拟免疫信号和基质信号转导所产生的影响。
结果显示，IFN-γ和TGFβ刺激均可引起WT小鼠和KPN小鼠肿瘤类器官干细胞指数转向RSC富集，而AKPT类器官（Tgfβr1受体失活）仅对IFN-γ刺激有反应（图3C）。这些结果表明，微环境中的免疫和基质来源的信号均能调节肿瘤干细胞的动态平衡。随后，作者在小鼠模型中模拟CBC-RSC平衡打破（白喉毒素清除CBC），但在CBC清除5天后的检测结果中，CBC-RSC平衡又恢复到给药前水平（详见原文），提示肿瘤微环境中存在肿瘤干细胞平衡状态的快速恢复和维持机制。
图3 微环境中细胞因子影响肿瘤干细胞动态变化
最后，为了对结直肠癌病人的分子表型变化进行可对比评估，作者利用FOxTROT疗法（氟嘧啶、奥沙利铂和靶向受体结肠癌术前治疗）试验数据集对比化疗前后患者干细胞指数变化（图4B）。结果表明，可以根据干细胞指数变化将患者分为“静态”组患者和“可塑”组患者（图4C），通过这样的分组可更准确地解释FOxTROT数据中原本同一类型的患者对化疗的不同响应结果（图4D-F）。
图4 干细胞指数的临床转化潜力
在这项研究中，作者使用RNA原位杂交（ISH）、多重荧光免疫组化（mIHC，文中应用到的就是Akoya的PhenoImager技术）和scRNA-seq技术，综合评估类器官、小鼠和人类肠道肿瘤组织中干细胞的动态平衡情况，并提出了一种适用于结肠癌患者化疗相应评估的高潜力指标——“干细胞指数”。
参考文献
1. Vasquez EG, Nasreddin N, Valbuena GN, et al. Dynamic and adaptive cancer stem cell population admixture in colorectal neoplasia. Cell Stem Cell. 2022 Aug 4;29(8):1213-1228.e8.
2. Barker N, van Es JH, Kuipers J, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 2007 449, 1003–1007.
3. Barker N, Ridgway RA, van Es JH, et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 2009 457, 608–611.
4. Schwitalla S, Fingerle A, Cammareri P, et al. Intestinal Tumorigenesis Initiated by Dedifferentiation and Acquisition of Stem-Celllike Properties. Cell. 2013 152, 25–38.
5. Fumagalli A, Oost KC, Kester L, et al. Plasticity of Lgr5-Negative Cancer Cells Drives Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Stem Cell. 2020 26, 569–578.e7. e567.
6. Han T, Goswami S, Hu Y, et al. Lineage Reversion Drives WNT Independence in Intestinal Cancer. Cancer Discov. 2020 10, 1590–1609.
关注我们
FOLLOW US
官方公众号
样本体验申请
技术服务需求
