经典案例合集 | 多重免疫荧光在乳腺癌研究中的应用，从这几个角度入手！
乳腺肿瘤微环境（TME）中包含着许多执行特定功能的细胞，近年发展起来的单细胞分析技术已经揭示了TME细胞多样性的程度，但尚未揭示这些细胞在空间中的组织方式。乳腺癌的肿瘤异质性极大，这些功能不同的细胞在确定病因和治疗方案方面非常重要。有研究发现肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）是对新辅助化疗反应良好的生物标志物，而肿瘤相关巨噬细胞（TAM）则与不良预后相关，是癌症免疫治疗的新靶点。另外，间充质细胞也已成为耐药性、驱动转移和抗肿瘤免疫的重要调节因子。
乳腺癌微生态环境主要由以下几个部分组成：
1）与肿瘤相关的巨噬细胞；
2）树突细胞；
3）T细胞；
4）间充质干细胞；
5）成纤维细胞；
6）内皮细胞。
具有一定特征的多细胞空间结构会影响肿瘤表型和临床治疗反应。在微生态环境中，每个细胞类型都有不同的生物贡献，它们会动态地相互作用，为乳腺癌细胞创造一个独特的微环境。通过多重免疫荧光(mIF)方法标记不同的蛋白标记物，实现对多种细胞类型的标记，可以帮助研究者更好的了解乳腺癌的肿瘤微环境组成和变化，从而更好的预测患者的预后和用药效果。下面我们总结了一些乳腺癌肿瘤微环境研究的代表研究，一起了解不同细胞类型对乳腺癌肿瘤微环境的作用和影响。
多重免疫荧光研究发现三级淋巴结构有利于乳腺癌预后
三级淋巴结构 (TLS) 是指个体出生后体内形成的位于非淋巴组织的组织性免疫细胞聚集结构。肿瘤中的 TLS 的存在与免疫治疗后更好的预后和临床结局相关。在三篇经典三级淋巴结构研究文章中，都纳入了乳腺癌作为研究对象。
案例一
题目：Mature tertiary lymphoid structures predict immune checkpoint inhibitor efficacy in solid tumors independently of PD-L1 expression
期刊：Nature Cancer, 2021
主要结果：
在波尔多大学研究团队的研究中，纳入了包括乳腺癌在内的多种肿瘤类型，研究了3个独立队列对PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂的治疗的反应，研究结果显示，除了PD-L1表达状态和CD8+ T细胞密度，成熟三级淋巴结构的存在，可以显著提升客观缓解率，无进展生存期和总生存期。[1]
案例二
题目：Spatial distribution of B cells and lymphocyte clusters as a predictor of triple-negative breast cancer outcome
期刊：npj Breast Cancer, 2021
主要结果：
美国西北大学和冷泉港联合发表的文章主要聚焦在B细胞与淋巴细胞簇（LC）的空间分布作为三阴性乳腺癌的预测指标。淋巴细胞簇由纯的T细胞或T细胞与B细胞混合组成，而TLS是淋巴细胞簇的子集。研究发现，各类型淋巴细胞簇在预后好的患者中相比预后差的患者中数量更多。[2]
案例三
题目：Fluorescent Multiplex Immunohistochemistry Coupled With Other State-Of-The-Art Techniques to Systematically Characterize the Tumor Immune Microenvironment
期刊：FRONT MOL BIOSCI, 2021
主要结果：
该研究构建了应用多重免疫荧光技术进行肿瘤微环境检测的方法学，对乳腺癌样本中的肿瘤淋巴细胞浸润和三级淋巴结构的检测建立了标准的研究方法。[3]
多重免疫荧光探索肿瘤相关巨噬细胞亚型对乳腺癌预后的影响
肿瘤相关巨噬细胞(TAM) 是肿瘤微环境研究中最为热门的免疫细胞亚群。越来越多的研究表明TAM具有支持肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等一系列促进肿瘤发展的功能，与肿瘤患者的不良预后呈高度相关性。应用多重免疫荧光技术，可以对肿瘤相关巨噬细胞进行更详细的分型，研究不同亚型肿瘤相关巨噬细胞对乳腺癌的促进或抑制作用。
案例四
题目：Identification of tumor-associated macrophage subsets that are associated with breast cancer prognosis
期刊：CLIN TRANSL MED, 2020
主要结果：
研究人员构建了包含等多个肿瘤免疫微环境，特别是巨噬细胞分型相关的标记物的多色免疫荧光检测组合。应用多个标记物组合预测不同巨噬细胞亚群的预后，验证了一个全新的与浸润型乳腺癌相关的巨噬细胞标记物——CD206。研究将乳腺癌患者组织中的巨噬细胞根据表面标记CD206的阴阳性进行分类。CD206+巨噬细胞与MORC4或SERPINH1共表达，这种分型的患者一般预后更好；CD206-巨噬细胞表达MHCII，该分型患者的预后更差。[4]
多重免疫荧光应用于乳腺癌临床试验中肿瘤微环境检测
除了应用于寻找与乳腺癌预后相关的组织或细胞标记物，多色免疫荧光技术还常被用于不同规模的临床试验。在临床试验中用于检测肿瘤免疫微环境，以及预测不同免疫微环境对临床用药的响应。以下是三篇典型的应用多重免疫荧光技术的临床试验的研究文章。
案例五
题目：Evaluation of the Predictive Role of Tumor Immune Infiltrate in Patients with HER2-Positive Breast Cancer Treated with Neoadjuvant Anti-HER2 Therapy without Chemotherapy
期刊：CLINICAL CANCER RESEARCH，2020
主要结果：
研究指出，在早期HER2+乳腺癌患者中，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）与曲妥单抗和化疗获益相关。研究设计了多重免疫荧光实验，用于检测肿瘤浸润淋巴细胞的浸润程度，亚型和其他相关免疫细胞对新辅助抗HER2治疗结果的影响。结果显示，淋巴细胞占主导的乳腺癌(LPBC)患者在治疗后有更高的病理完全缓解率。多重免疫荧光实验的定量结果帮助关联免疫细胞的亚型以及组织中免疫细胞构成与治疗结果的相关性。[5]
案例六
题目：Neoadjuvant Chemotherapy and Immunotherapy in Luminal B-like Breast Cancer: Results of the Phase II GIADA Trial
期刊：CLINICAL CANCER RESEARCH，2021
主要结果：
研究主要研究新辅助化疗对Luminal B型乳腺癌的治疗效果。研究结果显示，肿瘤浸润淋巴细胞，免疫相关基因表达情况，以及由多重免疫荧光实验鉴定的特定免疫细胞亚群与病理完全缓解率密切相关。根据多重免疫荧光实验结果，使用蒽环类药物后激活了肿瘤免疫微环境。[6]
研究中构建了如下两个多重免疫荧光检测组合：
案例七
题目：Immune microenvironment, homologous recombination deficiency, and therapeutic response to neoadjuvant chemotherapy in triple-negative breast cancer: Japan Breast Cancer Research Group (JBCRG)22 TR
期刊：BMC Medicine，2022
主要结果：
研究纳入了66例同源重组缺陷（HRD）或BRCA1/2基因突变的三阴性乳腺癌患者，分别接受两种新辅助化疗方案。结果发现，肿瘤体积更小的患者的瘤内CD8+T细胞密度更高。瘤内和基质中CD4+ T细胞数目与病理完全缓解率正相关，不受年龄，化疗计量，HRD状态和治疗方案影响。[7]
参考文献
1. Vanhersecke L, et. A. Mature tertiary lymphoid structures predict immune checkpoint inhibitor efficacy in solid tumors independently of PD-L1 expression. Nat Cancer. 2021 Aug;2(8):794-802. doi: 10.1038/s43018-021-00232-6. Epub 2021 Aug 12. PMID: 35118423; PMCID: PMC8809887.
2. Wortman JC, et. Spatial distribution of B cells and lymphocyte clusters as a predictor of triple-negative breast cancer outcome. NPJ Breast Cancer. 2021 Jul 1;7(1):84. doi: 10.1038/s41523-021-00291-z. PMID: 34210991; PMCID: PMC8249408.
3. Boisson A,et. Fluorescent Multiplex Immunohistochemistry Coupled With Other State-Of-The-Art Techniques to Systematically Characterize the Tumor Immune Microenvironment. Front Mol Biosci. 2021 Sep 21;8:673042. doi: 10.3389/fmolb.2021.673042. PMID: 34621785; PMCID: PMC8490683.
4. Strack E, et. Identification of tumor-associated macrophage subsets that are associated with breast cancer prognosis. Clin Transl Med. 2020 Dec;10(8):e239. doi: 10.1002/ctm2.239. PMID: 33377644; PMCID: PMC7719284.
5. De Angelis C, et. Evaluation of the Predictive Role of Tumor Immune Infiltrate in Patients with HER2-Positive Breast Cancer Treated with Neoadjuvant Anti-HER2 Therapy without Chemotherapy. Clin Cancer Res. 2020 Feb 1;26(3):738-745. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-19-1402. Epub 2019 Oct 25. PMID: 31653641; PMCID: PMC7002194.
6. Dieci MV, et. Neoadjuvant Chemotherapy and Immunotherapy in Luminal B-like Breast Cancer: Results of the Phase II GIADA Trial. Clin Cancer Res. 2022 Jan 15;28(2):308-317. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-21-2260. Epub 2021 Oct 19. PMID: 34667023.
7. Ueno T, et. Immune microenvironment, homologous recombination deficiency, and therapeutic response to neoadjuvant chemotherapy in triple-negative breast cancer: Japan Breast Cancer Research Group (JBCRG)22 TR. BMC Med. 2022 Apr 25;20(1):136. doi: 10.1186/s12916-022-02332-1. PMID: 35462552; PMCID: PMC9036790.
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