这篇北大团队Nature新作独到之处在哪里？带你详细盘点其创新思路
肝癌是以我国为代表的亚太地区高发癌症种类。世界卫生组织统计数据显示，我国肝癌发病率和死亡率占比分别约为全球的50%和55%。虽然有大量研究表明肿瘤免疫微环境（TIME）的异质性是造成肝癌转移、复发和耐药的主要原因，但针对TIME异质性进行患者分层一直缺少令人信服的方案。该《Nature》研究成果，在单细胞水平定义了肝癌的免疫微环境分型和中性粒细胞的异质性，对肝癌精准免疫诊疗意义重大[1]。
背景介绍
原发性肝癌（PLC）有三种主要的组织学亚型：肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（ICC）和肝细胞及肝内胆管联合癌（CHC）。临床上，对于早期肝癌患者可以通过手术切除、肝移植或射频消融等手段实现根治治疗；而对于晚期患者则主要采取限制疾病发展的保守治疗（如肝动脉栓塞化疗和索拉非尼靶向治疗）。虽然近几年PLC的免疫治疗取得了显著的进展，但依然缺少有效的生物标志物以更好地进行临床患者分层。目前，国际上通用的PLC分期方法主要有BCLC/TNM/JSH/APASL等方法。
在我国，肝癌分期的主要依据是国家卫生健康委员会制定的《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》方案——CNLC分期。上述分期方案根据肿瘤发病数量、转移情况和患者肝功能等因素进行分期考量，但这些传统患者分期方案并不能对当前靶向药物治疗和免疫治疗进行指导，导致新型治疗方案的临床响应率不甚理想。
大量研究表明，肿瘤免疫微环境（TIME）的异质性是导致免疫治疗响应程度差别的主要原因。机体免疫系统在遇到外来物质入侵时会调动免疫细胞并启动炎症免疫反应，在消灭了“入侵物”后，则会启动免疫抑制程序防止过度的炎症反应，同时维持适合组织损伤修复的微环境。而肿瘤就利用了机体的“免疫刹车”机制，在肿瘤组织内部募集大量的免疫抑制型细胞，构成免疫抑制微环境。由于个体差异，不同患者肿瘤内部募集的免疫抑制型细胞的种类和数量差异很大，患者之间的TIME状态大相径庭，进而导致同一种靶向药物无法适用于所有的患者。髓系细胞（Myeloid cells）的异质性一直是TIME研究的热点问题。已有报道证实，肿瘤内的巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞都有抗肿瘤和促肿瘤的活化形式[2]。其中，肿瘤相关中性粒细胞（TAN）具有更广泛的免疫抑制能力，在TIME中的作用功能越来越受到重视[3]。但因其寿命短、组织内浸润较少、分离难度大等特点，TAN在肝癌中扮演的具体角色一直存在争议。
单细胞技术以在基因、转录和蛋白水平展现每一个细胞的功能特性，为研究人员提供了更详细解读TIME中细胞功能和异质性的“利器”。不难推测，基于单细胞技术的TIME的患者分层方案能更明确地找出适合免疫治疗的肝癌患者。
研究方法
俗话说：“久病成良医。”国内肝癌的高发使得我国在肝癌研究领域涌现出一批优秀的科学家，致力于肝癌的机制研究和临床转化。这篇题为“Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity”的研究成果就是一个典型案例。该研究来自于国内几个团队的合作。
北京大学第一医院肿瘤转化研究中心的张宁团队、北京大学生物医学前沿创新中心张泽民团队和北京大学人民医院肝胆外科朱继业团队将各自团队的技术优势整合在一起，利用scRNA-seq、WES（全外显子组测序）、PhenoCycler（原CODEX）单细胞原位空间表型、多重免疫荧光、免疫细胞清除等技术，详细分析了肝癌患者样本和小鼠疾病模型中收集的189个样本的单细胞结构，提出了基于微环境5个亚型的肝癌患者分层体系（命名为“TIMELASER”）（见图1），并揭示了肝癌组织中TAN的异质性。
接下来，我们就从文章中肝癌微环境分型和TAN异质性解析这两个研究亮点出发，来学习一下高水平科研团队的研究思路。
图1 基于肿瘤免疫微环境的TIMELASER肝癌分型示意图
研究过程
1.单细胞分析揭示肝癌患者的5种TIME亚型
相较于以往研究，本研究比较有特色的地方在于：作者利用了自己研究团队建立的细胞分离体系[4]，有效地避免了抗体富集操作导致的检测样本中细胞亚群缺失，在保留单细胞样本的异质性的同时，实现了189个样本（124个病例的160个样本和8只小鼠的29个新鲜组织样本）的单细胞转录组测序（见图2）。随后，作者对测序结果进行解析，按照T细胞（29亚群）、NK和B细胞（11亚群）、髓系细胞（32亚群）以及上皮和间质细胞（17亚群）的分类线索，将上百万个细胞细分为89个细胞亚群。这样前所未有精细程度的细胞亚群分析为接下来深入研究TIME的异质性提供了强大的转录组学基础。
图2 肝癌单细胞检测实验流程和细胞亚群分析
细胞亚群分类完成后，作者将单细胞数据回溯到患者个体中，详细对比患者之间的TIME差异。不出所料，不同患者之间肿瘤组织中募集的细胞种类和比例均存在显著的差异性。
层次聚类分析（Hierarchy clustering）结果显示，这些肝癌患者中主要有5种不同的TIME亚型（图3）：免疫激活型TIME-IA (Immune Activation) 、髓系富集免疫抑制型TIME-ISM (Immune Suppressive Myeloid)、基质富集免疫抑制型TIME-ISS (Immune Suppressive Stromal)、免疫排斥型TIME-IE（Immune Exclusion) 和免疫驻留型TIME-IR (Immune Residence)。随后，作者对不同TIME亚型患者的数据进行了临床病理进程、细胞活化差异和细胞因子表达差异对比分析，进一步证实了不同TIME亚型之间的异质性。另外，结合84位患者的WES数据，作者还发现，不同TIME亚型间细胞募集的差异由患者基因突变（如TP53, CTNNB1, KRAS 和IDH1等）差异导致（详见原文结果）。
图3 肝癌TIME亚型分析
在单细胞生信分析的基础上，作者利用PhenoCycler（原CODEX）单细胞原位空间表型分析技术进一步对患者肿瘤组织中的免疫分布进行了分析（图4）。根据免疫细胞表型分析需求，作者设计了15-plex的PhenoCycler检测（β-catenin，CD3e，CD4，CD8，CD11c，CD20，CD31，CD45RO，CD68，E-cadherin，HLA-DR，keratin14，Ki-67，MAC2/galectin-3和pan-cytokeratin），PhenoCycler单细胞原位空间表型分析将肿瘤组织内各种细胞的分布情况以可视化的方式展示出来，弥补了scRNA-seq技术在原位信息呈现上的不足，进而完成了几种TIME亚型模式图的总结（图1）。至此，作者提出了基于TIME单细胞检测的肝癌分型方法，并将其命名为“TIMELASER”。
图4 肝癌TIME亚型细胞原位分布对比
2.肝癌组织中性粒细胞异质性分析揭示6种TAN亚群
在建立了TIMELASER体系后，作者在分析各个肝癌TIME亚型患者无进展生存期（PFS）数据时，发现TIME-ISM患者肿瘤组织内中性粒细胞的募集和其PFS呈显著的负相关（图3e）。考虑到TIME-ISM亚型主要为胆管癌（ICC）患者，作者单独提取了ICC患者来源的肿瘤组织中的34307个中性粒细胞数据用于中性粒细胞异质性分析。聚类分析结果显示，这3万多个中性粒细胞是由11种不同的亚群组成，其中外周血来源的有3个亚群，癌旁组织来源的有2个亚群，另外6种均为肿瘤组织内特有的中性粒细胞（也就是TAN，图5）。接下来，作者通过TAN的体外诱导和患者TAN的离体分析等实验找出了6个亚群中对肿瘤进展有促进作用的2种TAN，即CCL4+TAN（通过招募巨噬细胞）和PD-L1+TAN（通过抑制T细胞活性）。
另外，作者对小鼠中性粒细胞亚群的scRNA-seq分析结果表明，小鼠与人类的肝癌组织内募集的中性粒细胞呈现相近的基因转录水平状态（详见原文结果）。
图5 肝癌组织中肿瘤相关中性粒细胞（TAN）异质性分析
结论
这项研究提出了基于TIME进行肝癌患者分型的体系，详细解析了肿瘤内TAN的异质性，并找出了两种ICC治疗的潜在靶细胞。相信在不久的将来，TIME-ISM型ICC患者的治疗方案中会有靶向TAN的免疫疗法。
参考文献
1. Xue, R., Zhang, Q., Cao, Q. et al. Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity. Nature (2022).
2. Jaillon, S. et al. Neutrophil diversity and plasticity in tumour progression and therapy. Nat. Rev. Cancer 20, 485–503 (2020).
3. Yang, L. et al. DNA of neutrophil extracellular traps promotes cancer metastasis via
CCDC25. Nature 583, 133–138 (2020).
4. Zhang, Q. et al. Landscape and dynamics of single immune cells in hepatocellular
carcinoma. Cell 179, 829–845(2019).
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