单细胞多组学 空间多组学又一篇高分文章重磅来袭！

近几十年以来，随着高通量测序技术的不断发展，人们已经能够在不同组学的层面鉴定到成千上万个潜在的致病突变。众所周知，每一种组学（基因组、表观组、转录组、蛋白组等）都能够在其对应层面提供很多与疾病相关的差异信息。而在最近，通过整合不同组学数据从而鉴定与疾病相关的分子模式的系统生物学方法，已经得到科研人员越来越多的关注。其中单细胞多组学和空间多组学技术更是炙手可热，两种技术的结合将有助于发掘单个细胞和空间背景环境之间更深层次的信息，而这些信息对于发现疾病治疗的靶点，或探究精准诊疗手段都有十分重要的意义。

在今天分享的文章中，来自美国斯坦福大学医学院的Michael T. Longaker团队就使用了单细胞多组学和空间多组学结合的分析方法，研究了癌症相关的成纤维细胞（CAFs）的单细胞基因表达（10x scRNA-seq）和单细胞染色质可及性（10x scATAC-seq），并结合空间转录组学（10x Visium）和空间蛋白质组学（Akoya CODEX，现更名为：PhenoCycler-Fusion）验证了多种实体瘤类型和物种，以物种和肿瘤不可知的方式阐明新的CAF特异性治疗靶点，为未来的癌症生物学研究提供多模态组学框架。

80%的癌症死亡是实体瘤导致，靶向肿瘤微环境（TME）中多种细胞类型能提升治疗效率。癌症相关成纤维细胞（CAFs）是实体瘤TME中重要的一部分，参与肿瘤增殖、侵袭和转移。CAF曾经被认为是一个相对统一的基质生产细胞群体，之前的研究通过单细胞测序揭示了不同的CAF表型，不过目前对CAF异质性和功能的理解尚不全面。

为了全面描述CAF异质性，作者首先对乳腺癌小鼠模型（MMTV:PyMT）肿瘤样本进行单细胞测序，鉴定出了6个CAF亚群（mBrRNA 0-5），将Pi16、Dpp4、Dpt和Cd34共表达的群体称作稳态（SSL）型，将与机械传导、胞外基质相关的群体称为机械反应（MR）型，将与多种炎症途径、抗原呈递相关的群体称为免疫调节（IM）型。这些群组在不同小鼠肿瘤分析中的分布高度相似，之后作者使用CytoTRACE评估了这些CAF群组的相对分化状态，与IM CAF相比MR CAF的分化程度较低。

为了评估实体瘤背景下与CAF活化相关的表观基因组变化，作者进一步使用单细胞染色质可及性（scATAC-seq）分析，并与之前的单细胞转录组数据整合，发现scRNA-seq得到的6个CAF亚群中的4个可以映射到scATAC基因型亚群，这说明CAF异质性在一定程度上是由染色质水平决定的。接着作者利用10x多组学平台分别分析了非肿瘤乳腺组织、小鼠早期乳腺肿瘤和晚期乳腺肿瘤，鉴定出8个CAF类群（mBr^Multi 0-8），作者发现不同时期的肿瘤组织中CAF细胞数量不同，mBr^Multi类群都能相应地在mBrRNA类群中找到对应。进一步地将ATAC数据合并后，发现不同类群中高度开放的转录因子结合基序，如IM型CAF中的Stat2，MR型CAF中Smad2::Smad3。有趣的是，作者发现Runx1基序在IM和MR型中都开放，说明这些类群可能比SSL型分化程度更高，而MR型相较于IM型，分化程度略低。至此，作者找到了CAFs转录和表观上的联系，它们支持着癌症进展。

接下来，作者用10x Visium进一步探究CAF的空间转录组。利用多组对评估的转录组图谱，作者预测出了斑点（spot）中非成纤维细胞的分布，他们发现IM型CAFs多与淋巴免疫细胞共定位，MR型CAFs多与上皮细胞共定位，MR和IM基因只在局部高表达。总之，作者利用空间转录组分析将成纤维细胞簇定位在内源性mBr肿瘤的复杂组织结构中。

作者为了进一步探索这些小鼠乳腺CAF亚群在组织水平上的谱系，采用了Rainbow小鼠模型进行多色谱系追踪，发现两个CAF亚群都表现出强大的多克隆性，在所有小鼠中都有异质的克隆表达。aSMA是肌成纤维细胞的一个公认标志物，在空间转录组分析中该亚组强烈表达。作者用CODEX空间蛋白质组学（CODEX现更名为PhenoCycler-Fusion）鉴定出细胞类群特异表达的蛋白质，结合荧光成像，SSL和IM CAF表现出与aSMA谱系诱导的mCerulean、mCherry和mOrange克隆群体相关的荧光，证实了aSMA阳性成纤维细胞的谱系可塑性。总之，这些数据支持MR CAF区分于SSL或IM CAF的潜在能力。

接下来为了评估了小鼠和人类对肿瘤的局部成纤维细胞反应在进化上的保守程度。作者收集了3例乳腺癌病人样本进行单细胞转录组测序，鉴定出了6个CAF亚群，与之前的SSL、MR、IM型CAF群组对应得很好，尽管来自三个不同患者的肿瘤在年龄、肿瘤类型和分期方面存在差异，但群组的分布没有显著差异。

为了进一步评估人类乳腺（hBrRNA）CAF亚群是否与小鼠乳腺（mBrRNA）CAF中亚群相似，作者使用正交对数映射结合Seurat的标记转移方法进行了整合的跨物种分析，再次发现两者惊人地相似，表明CAF存在强烈的进化保守性。为了探究CAF的这一特征是否在不同肿瘤中保守，作者随后整合了胰腺导管腺癌（PDAC）的样本数据。在转录组水平鉴定出7个亚群，基于标签转移的整合，发现其中5个亚群都能在乳腺癌数据中找到对应，只有1个亚群（hBrRNA-hPaRNA-3）仅由胰腺CAFs构成。然而，跨物种分析显示6个亚群都与乳腺癌对应亚群存在相似性，其中hBrRNA-hPaRNA-3相似的细胞数量相对较少。至此，作者发现了CAF在不同物种及不同肿瘤类型间的保守性。

最后，作者想知道MR和IM型CAF亚群的功能，发现在小鼠模型中FAK的敲除会导致MR和IM CAFs的减少，而肿瘤生长会显著增加，而纤维化会减少，这提示CAF亚群的比例能够引导肿瘤生长。随后作者纳入接受免疫检查点抑制疗法前后的病人转录组数据，发现免疫疗法确实会刺激CAFs发挥更多功能，即产生更多MR或IM相关程序。

在探究复杂疾病的致病机制时，单一组学表征的往往是变异与表型之间的相关性或者反应性，而不是因果关系。通过将不同组学的数据进行整合，有助于我们全面地描绘疾病的基因调控网络，深度解析复杂的生物过程。本研究结合单细胞多组学和空间多组学技术，以更高的分辨率定义了CAF生物学的时间和空间动力学，描绘了决定CAF分化的关键调控途径，为后续研究肿瘤的发生发展，癌症精准诊疗均提供了很好的思路。

目前，单细胞多组学+空间多组学的研究模式已经在癌症研究、神经科学、生殖发育等多个领域得到广泛使用，助力解析了多个复杂生物学问题。基于当前的研究热点，云准可以为您提供单细胞多组学和空间多组学联合的一站式解决方案，包括单细胞转录组，单细胞ATAC，单细胞免疫组库，空间转录组，空间原位蛋白组，以及其联合分析，为科研人员探索生命现象的深层机理提供崭新的视角和技术方案。若您想要咨询更多信息，请及时与我们联系。