经典案例合集 | 国内结直肠癌研究团队这样用多重免疫荧光技术！
结直肠癌（CRC）因其高发病率、早期症状不明显以及高致死率等特征一直受到人们的重视。跟据“中国中晚期结直肠癌患者诊疗现状调查”项目统计数据，我国83%的CRC患者在首次确诊时处于中晚期，其中44%的患者已出现肝、肺等部位的转移。CRC的治疗方法主要有手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗及中医药治疗等。早期CRC以手术治疗为主，术后五年生存率高于80%。晚期CRC因复发和转移多发，总体预后不理想，平均生存期仅为一年。
目前，国际上CRC的常用病理分期方法有TNM分期和Dukes分期。另外，针对CRC的异质性特点，采用2015年发布的共识分子亚型（consensus molecular subtypes，CMS）方案将CRC患者分为4个亚型[3]。
CRC的发病主要由三个因素导致：染色体不稳定性（chromosome instability）占CRC患者的70～90%；CpG岛甲基化表型（CpG island methylator phenotype）占10～20%；错配修复基因突变(different mis-match repair)较为少见。肠道上皮细胞癌变后，在不断增殖的情况下，通过机体免疫抑制机制形成肿瘤组织内部的免疫抑制微环境，从而逃避免疫系统的监视与攻击。研究表明，肠癌免疫微环境中的免疫细胞在不同的活化条件下既可能识别并杀伤肿瘤细胞来抑制肿瘤的生长，也可能发挥促进肿瘤细胞存活、增殖、转移以及促血管生成的作用。另外，肠道组织结构的特殊性和肠道微生物在肠癌微环境中所扮演的角色也越来越多地成为研究关注的焦点[4]。
多重免疫荧光（mIHC/mIF）多标志物原位检测的技术特点，在微环境细胞亚群定量、细胞空间相关性分析、患者病理分型等场景中应用广泛。近年来，mIHC技术被广泛地应用于肿瘤微环境研究和临床前研究，大量课题用微环境分析来解读肿瘤发生、增殖、转移和免疫逃逸过程中细胞募集和发挥功能的机制。
案例一
题目：USP14 promotes tryptophan metabolism and immune suppression by stabilizing IDO1 in colorectal cancer
期刊：Nature Communications, 2022
作者单位：中山大学廖雯婷，宋立兵及香港中文大学刘国珍多团队
研究摘要：
吲哚胺2，3双加氧酶1（IDO1）是癌症免疫治疗的热点靶标之一。然而，IDO1抑制剂在临床试验中结果并不理想，主要是因为直接抑制IDO1会导致芳烃受体（AhR）的活化。这项研究中，作者揭示了结直肠癌（CRC）中由蛋白酶体相关去泛素化酶USP14调节的IDO1转录后调节机制。USP14的过表达通过稳定IDO1蛋白促进色氨酸代谢和T细胞功能障碍。在MC38小鼠模型中，敲低或小分子药物抑制USP14可以靶向降低IDO1表达，逆转细胞毒性T细胞的功能障碍，并增加对抗PD-1疗法的响应。作者还发现，抑制USP14对IDO1抑制剂诱导的AhR活化没有影响。这些发现揭示了USP14在IDO1的翻译后调节和抗肿瘤免疫抑制中的相关作用，表明USP14是CRC免疫治疗（特别是针对IDO1高表达患者）潜在的分子靶标。[5]
这篇文章中，作者使用mIHC技术作为原位细胞亚群定量分析的主要手段。不难看出，研究人员通过对Opal多色标记体系的娴熟使用，从IDO1表达分析的对比，到靶向干预后关键效应细胞比例变化的验证，再到临床组织样本中对USP14表达差异患者的细胞定量，种种关键研究环节中都能看到漂亮的mIHC结果。
生物标志物方案：
Panel 1：CK、IDO1、CD3、CD8
Panel 2：CD4、FoxP3、CD8、Granzyme B
案例二
题目：Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level
期刊：Cancer Discovery, 2022
作者单位：复旦大学高强、樊嘉及中国科学院上海巴斯德研究所张晓明多团队
研究摘要：
肝转移是结直肠癌死亡的主要原因，肿瘤转移灶往往表现出高度异质性和抑制性的免疫微环境。在这项研究中，作者使用单细胞RNA测序和空间转录组学对97个样品进行了测序。结果显示，转移微环境对免疫抑制细胞（一种M2样巨噬细胞）进行了空间重编程。研究者进一步开发了scMetabolism方法（用于量化单细胞代谢水平计算），检测到该巨噬细胞亚群代谢活性显著增强。有趣的是，新辅助化疗可以阻断这种状态并恢复治疗响应组患者的抗肿瘤免疫反应（治疗不响应组患者则发生免疫抑制的增强）。这篇文章不仅完成了结直肠肝转移样本的单细胞测序和空间图谱分析，并在转移部位发现了高度代谢激活的M2样巨噬细胞。研究表明，新辅助化疗可以有效减缓这种代谢激活，通过靶向代谢途径的方法可抑制肿瘤转移。[6]
本研究中，作者首先将scRNA-seq和空间转录组技术整合，详细分析了结直肠癌肝转移样本中免疫细胞的异质性，找出潜在有意义的蛋白表达变化。再利用PhenoImager mIHC技术进行细胞功能变化的验证，精确找出结直肠癌中发生代谢变化的MRC1+ CCL18+巨噬细胞。
生物标志物方案：
Panel 1：CD4、Foxp3
Panel 2：CCL18、SPP1、MKI67、CD68
Panel 3：PanCK、CD47、CCL18、CD68、SIRPα
Panel 4：PanCK、CD47、SPP1、CD68、SIRPα
案例三
题目：XBP1 regulates the protumoral function of tumor-associated macrophages in human colorectal cancer
期刊：Signal Transduction and Targeted Therapy, 2021
作者单位：中国医学科学院及北京协和医学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室朱红霞及徐宁志多团队
研究摘要：
巨噬细胞是结直肠癌（CRC）中最丰富的免疫细胞之一。重新教育肿瘤相关巨噬细胞（TAM），将其从促肿瘤活化形式转变为抗肿瘤活化形式，被认为是一种有潜力的治疗策略。然而，TAM激活过程中发挥关键作用的分子及作用机制仍知之甚少。在这项研究中，作者对CRC中浸润的CD206+TAM进行RNA-seq分析，发现在未折叠的蛋白质/内质网胁迫反应过程中富集大量差异表达基因，并且在TAM中特异性观察到XBP1剪接/激活。TAMs中XBP1的激活促进了结直肠癌的生长和转移。靶向敲除XBP1不仅可以抑制TAMs中促肿瘤细胞因子（包括IL-6，VEGFA和IL-4）的表达，还可以直接抑制SIRPα和THBS1的表达（阻断“不要吃我”的识别信号，增强巨噬细胞吞噬作用）。作者还发现，使用AAV2-sgXBP1的治疗性XBP1基因编辑增强了抗肿瘤活性，提示靶向 TAM 中的 XBP1 信号传导可作为 CRC 的潜在治疗目标。[7]
本研究中，作者的研究思路明确地靶向了TAM活化形式的转变，在利用测序技术检测TAM活化形式改变的同时，用PhenImager mIHC检测细胞空间分布变化。比较有特色地是，作者将mIHC结果呈现为表型分析的图像形式（不仅在mIHC结果中显示单个指标阳性细胞分布位置，还显示双阳性细胞的分布位置），在图像中直观地展现了关键表型细胞的分布定位。
生物标志物方案：
Panel 1：CD68、CD206、XBP1
Panel 2：F4/80、CD206、XBP1
案例四
题目：Transdifferentiation of tumor infiltrating innate lymphoid cells during progression of colorectal cancer
期刊：Cell Research, 2020
作者单位：中国科学院微生物研究所王硕，中国科学院生物物理研究所田勇及中国医学科学院及北京协和医院应建明多团队
研究摘要：
存在于肠黏膜表面的先天淋巴细胞（ILC）不仅能增强免疫反应，还能维持黏膜完整性和组织稳态。然而，肿瘤浸润ILCs如何调节肿瘤的发展尚不清楚。在此研究中，作者通过单细胞RNA测序分析了结直肠癌（CRC）进展过程中肿瘤浸润ILC，并确定了六种具有独特特征的肿瘤浸润ILC细胞群。ILC1s表达抑制性受体，在结直肠癌晚期发生抑制性功能转化。ILC2分为三个亚群（称为ILC2-A，-B，-C），其中ILC2-C亚群可以促进肿瘤进展。HS3ST1和PD1在晚期结直肠癌ILC2中高表达（ILC2s中HS3ST1或PD1缺乏会抑制肿瘤的生长）。此外，ILC3s在CRC进展过程中转分化为可促进肿瘤生长的ILCregs。作者还发现，TGF-β信号转导启动了ILC3向ILCregs的转化，反之阻断TGF-β信号传导会破坏ILCreg转分化且抑制肿瘤生长。因此，对ILC转分化的干预可能是CRC免疫治疗的潜在靶标。[8]
这篇文章中，作者用Opal标记了转基因小鼠的荧光蛋白信号（荧光蛋白抗体标记后用Opal识别该荧光蛋白抗体，详见原文），实现多种标志物的信号放大和图像采集，巧妙地完成了细胞功能性标志物的原位分析。
生物标志物方案：
Panel：GFP、tdTomato、Lin、RORγt
案例五
题目：LncGata6 maintains stemness of intestinal stem cells and promotes intestinal tumorigenesis
期刊：Nature Cell Biology, 2018
作者单位：中科院生物物理所范祖森及田勇团队
研究摘要：
上皮组织具有很强的自我更新能力，通常由隐窝底部的Lgr5+肠道干细胞驱动。然而，维持Lgr5+肠道干细胞特性的分子机制尚不完全清楚。这项研究的结果表明，Gata6长非编码RNA（lncGata6）在肠道干细胞中高度表达。肠道干细胞中LncGata6 的敲除会减弱肠道干细胞的促上皮再生能力。在作用机制方面，lncGata6能够将NURF复合物招募到Ehf启动子上激活转录，从而促进Lgr4/5的表达从而激活Wnt信号通路。此外，lncGata6的同源物lncGATA6在结直肠癌组织中的肿瘤干细胞中高表达，并促进肿瘤的发生发展。针对lncGATA6的反义寡核苷酸对结直肠癌表现出较强的治疗效果。因此，将lncGATA6作为治疗靶点在结直肠癌治疗中可能具有临床应用的前景。[9]
本研究中，作者采用了典型的《NCB》研究思路：分别从研究对象（lncGATA6）确认、关键分子功能研究、关键靶蛋白研究、靶基因研究、下游信号通路研究和临床靶点可行性研究等方面展开。研究过程中，作者多次使用荧光蛋白标记结合酪胺信号放大技术对功能分子进行mIHC检测。PhenoImager放大荧光信号的技术优势完美地帮助作者完成了样本中表达丰度不高的“弱信号”的mIHC检测。
生物标志物方案：
Panel 1：LncGATA6、GATA6、OLFM4、DLL1、KRT20
Panel 2：GFP（Lgr5）、WGA、E-cad、BrdU
参考文献
1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA: a cancer journal for clinicians. 2021, 71, 209-249
2. Baidoun F, Elshiwy K, Elkeraie Y, et al. Colorectal Cancer Epidemiology: Recent Trends and Impact on Outcomes. Curr Drug Targets. 2021;22(9):998-1009.
3. Stintzing S, Lenz HJ, Neureiter D, et al. Consensus molecular subgroups (CMS) of colorectal cancer (CRC) and first-line efficacy of FOLFIRI plus cetuximab or bevacizumab in the FIRE3 (AIO KRK-0306) trial[J].J Clin Oncol,2017,35(15):3510-3520.
4. Hanahan D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 2022 Jan;12(1):31-46.
5. Shi D, Wu X, Jian Y, et al. USP14 promotes tryptophan metabolism and immune suppression by stabilizing IDO1 in colorectal cancer. Nat Commun. 2022 Sep 26;13(1):5644.
6. Wu Y, Yang S, Ma J, et al. Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level. Cancer Discov. 2022 Jan;12(1):134-153.
7. Zhao Y, Zhang W, Huo M, et al. XBP1 regulates the protumoral function of tumor-associated macrophages in human colorectal cancer. Signal Transduct Target Ther. 2021 Oct 20;6(1):357.
8. Wang S, Qu Y, Xia P, et al. Transdifferentiation of tumor infiltrating innate lymphoid cells during progression of colorectal cancer. Cell Res. 2020 Jul;30(7):610-622.
9. Zhu P, Wu J, Wang Y, et al. LncGata6 maintains stemness of intestinal stem cells and promotes intestinal tumorigenesis. Nat Cell Biol. 2018 Oct;20(10):1134-1144.
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