Cell子刊（IF=43）：单细胞 空间多组学分析揭示B细胞可阻碍肠道修复

文章亮点

研究结果

1、结肠炎模型显示B细胞在肠粘膜修复期大幅扩增

为了深入了解结肠粘膜愈合(Mucosal healing，MH)的细胞调控机制，作者首先在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中，研究了肠道损伤至修复完成期间的细胞浸润情况。炎症产生到恢复阶段的细胞动态变化证实(Fig.1A~C)，肠损伤后的第14天，粘膜组织便几乎完成修复，而炎症(7~10天)至愈合期间均观察到免疫细胞浸润现象。为了全面研究细胞组成，首先使用流式细胞技术展示肠道免疫细胞图谱(Fig.1D~E)。在探索不同修复阶段的细胞招募情况时发现，CD11C^-B220⁺(B细胞)在第14天占据了免疫细胞主导地位(Fig.1F)，组织损伤区域的分析结果也同样显示(Fig.1G)，溃疡上皮附近浸润的B细胞数量剧增，而其他细胞类型则恢复到了炎症前的水平。

此外，在酸杆菌感染模型中也观察到结肠组织B细胞的扩张情况，表明在肠粘膜修复期间，B细胞的扩增浸润并不局限于单一的感染损伤类型。结合在溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)患者的公共数据集发现，B细胞在肠炎发生期间大幅扩增(Fig.1H)，成为结肠组织中最主要的免疫细胞类型。

图1  结肠炎模型的免疫细胞动态结果显示B细胞在损伤修复期间的扩增状态

2、scRNA-seq分析揭示了肠道修复过程中B细胞亚群的动态变化

为了描述和识别肠道修复期间的B细胞亚群，基于scRNA-seq对第0天和第14天的CD45⁺CD3^-CD19⁺B细胞进行单细胞转录组学分析(Fig.2)。以Ms4a1、Cd19等作为marker基因，采用无监督聚类可视化了9个不同的B或浆细胞亚群(Fig.2C~D)，定义为Naive B cells(Sell)、Plasma cells(Jchain，Ccr10)、Memory B cells(Cd44，Ccr6)、Marginal zone B cells(Cd9)、Interferon(IFN)-induced B cells(Ifi47)和GC light zone(LZ)B cells(Myc，Nfkbld，Hspa1a)。

与第0天相比，第14天样本中IFN-诱导的B细胞扩增了约7倍(Fig.2E)。在GO富集分析结果中观察到，IFN-诱导的B细胞富集了与干扰素反应和抗原提呈相关的基因(Fig.2F)。对比IFN-诱导的B细胞亚群与其他亚群时发现，在自身免疫性疾病中具有抑制炎症功能的细胞因子Cd274(PD-L1)和Ly6a(Sca-1)在IFN-诱导的B细胞中高表达(Fig.2K)。免疫荧光结果也同时验证了肠道修复期间(第14天)的小鼠结肠中，这群IFN-诱导的B细胞亚群(CD19⁺Sca-1⁺PD-L1⁺)主要分布于受损区域，在健康区域中存在感较低(Fig.2L)。

图2  scRNA分析显示肠道粘膜修复过程中的B细胞亚群特征

3、B细胞的耗竭引起肠粘膜组织再生能力的增强

为了探索B细胞耗竭反应(B cell depletion，BCD)对肠粘膜修复的影响，在DSS诱导的肠道炎症恢复期(第9、10、12和13天)的CD19cre-iDTR^HET小鼠(该模型在白喉毒素给药期间针对性消耗CD19⁺细胞)腹腔注射白喉毒素(Fig.3A)。与对照组相比，白喉毒素的给药治疗严重导致了B细胞的耗竭(Fig.3D)，此外，组织学分析显示，B细胞产生耗竭反应的期间，肠粘膜溃疡区域明显减少(Fig.3H~I)，这表明B细胞的扩增在极大程度上干扰了粘膜组织的修复。

KEGG通路富集分析结果显示，参与细胞因子信号传导和炎症反应的基因，如Tnf、Il1b、Il18、Cxcl10、Cxcl5和Soc3，在B细胞耗竭反应中下调(Fig.3K)。相比之下，B细胞的耗损会增强另一些细胞因子的表达，如细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)转录因子、上皮发育和粘蛋白生物合成因子(Fig.3K)，这表明B细胞影响着肠道炎症发生和组织重塑过程。

图3  肠炎修复过程中，B细胞的耗竭促进了粘膜组织的再生

4、肠粘膜修复过程中，B细胞的耗竭不会影响上皮与基质细胞的组成

为了探索对照组和BCD组之间上皮细胞和基质细胞组成的潜在变化，从scRNA-seq数据集中挑选Epcam⁺肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells，IECs)和Vim⁺基质细胞进一步分析(Fig.4)，共得到了6个上皮细胞亚群和8个基质细胞亚群(Fig.4B~E)。

根据marker基因表达，将上皮细胞分别定义为肠干细胞 Stem cells(Lgr5，Olfm4，Ascl2和Axin2)、杯状细胞Goblet cells(GC；Muc2，Agr2，Klf4和Tff3)、肠内分泌细胞Entero-endocrine cells(EEC；Chga，Chgb，Tac1和Tph1)、上皮-间充质转化(EMT)细胞(Vim，Sparc，Foxf1和Tgfbr2)，以及2个肠上皮细胞Enterocytes亚群(E1和E2；Alpi和Mep1a)。将基质细胞分别定义为肌成纤维细胞(MFs)、平滑肌细胞(SMs；Acta2，Actg2和Myh11)、周细胞(PC；Rgs5，Cspg4，Pdgfrb和Nes)、Cajal间质细胞(ICCs；Kit、Ano1、Epha7、Elovl6和Gja1)和成纤维细胞样ICC细胞(Fibroblast-like ICCs，FL-ICCs，结合了ICC特征基因和成纤维细胞特征基因)。其余4个簇被定义为Telocytes(Pdgfra^hi Foxl1⁺ Wnt5a^hi)、Trophcytes(Pdgfra⁺ Grem1⁺ Cd81⁺)、Bmp5⁺基质细胞(Pdgfra^lo Bmp5⁺)和Pdgfra^hi ISCs(Intestinal stem cells，Pdgfra^hi Grem1^neg Cd81⁺)。

对比两组细胞类群发现，BCD组中E2细胞数略有增加，EMT和EEC略有减少，而Telocytes在对照组中显著增加。从DEG变化中可以观察到，Eln、Sparc和一些胶原蛋白基因在BCD组上调，scRNA-seq分析显示肠粘膜修复期间，B细胞的缺失并不会影响IEC和基质细胞的组成，但会显著干扰与组织重塑相关的基因表达。

图4  组织修复过程中基质细胞和上皮细胞的组成变化

5、B细胞减少基质细胞和上皮细胞之间的相互作用

为了深入了解哪些细胞在同一个组织空间内可能存在相互作用，作者利用空间转录组测序进行分析，并整合了scRNA-seq数据（Fig.5A），推断出与淋巴结构相关的活动图，损伤和重塑区域，以及与 B 细胞和 TLS 相关的活性图。接下来作者将scRNA-seq获得的簇映射到这些区域，尽管表征杯状细胞 （GB）、MF/SM、ICC、FL-ICC、EEC 和 E2 的基因特征几乎完全排除在损伤和重塑区域之外（Fig. S5B），但表征 EMT、E1 和 ISC 以及、Telocytes、Trophocytes、Bmp5⁺基质细胞 （SC） 和 Pdgfra SC 的基因特征主要存在于这些区域（图 5C）。使用SingleCellSignalR过滤掉细胞内基因后，观察到与对照小鼠相比，BCD中基质和IEC单细胞数据集之间的潜在相互作用总体增加。KEGG信号通路分析显示，BCD中ECM受体的潜在相互作用以及粘附性增加（Fig.5D）。在Bmp5⁺基质细胞 （SC）中观察到潜在配体的最高BCD /对照比，而在E1和EMT中富集受体表达的BCD/对照比（Fig.S5 C），与对照动物相比，观察到的Bmp5 SCs与BCD中E1或EMT之间的潜在相互作用增加一致（Fig.5E）。

图5  上皮和基质细胞scRNA-seq数据映射到空间数据集

6、BCD缩短基质成纤维细胞和上皮细胞之间的距离

为了研究B细胞是否影响基质细胞和上皮细胞之间的物理相互作用，作者对B细胞（CD19），SMs / MFs（SMA），内皮细胞（CD31），Trophcytes（Pdgfra⁺）和上皮细胞（EpCAM）等进行了多重免疫荧光染色，在接受肠粘膜修复的对照结肠中（Fig.5E）。观察到在修复期间，B细胞的存在与上皮细胞（EpCAM）密切接触的内皮细胞（CD31）和基质细胞（Pdgfra⁺）的缺失有关（图6E）。作者也观察到B细胞附近胶原蛋白VI的表达降低（Fig.6E），表明B细胞损害了胶原蛋白介导的重塑。BCD则会使整个成纤维细胞（Vimentin）和Trophcytes（Pdgfra⁺）与相邻上皮细胞更接近（Fig.6E-6G）。这些结果表明，B细胞扩增在物理上扰乱了结肠粘膜愈合的基质 - 上皮ISC生态位。

图6  B细胞增多破坏了基质-上皮接近

7、活化的B细胞干扰了基质-上皮细胞间的相互作用

为了探究B细胞增殖过程中，是否影响了基质-上皮细胞间的串联作用，作者设计了一个原代成纤维-上皮类器官共培养系统，该系统中类器官细胞的存活率与分化率，和周围成纤维细胞的数量成正比(Fig.7A~B)。然而，添加了活化的B细胞后会降低类器官细胞的存活率，并且受IFN-诱导的B细胞占比的影响较大(Fig.7C~D)。

此外，BCD组小鼠的类器官中观察到更丰富的肠隐窝结构形成，这表明低浓度的B细胞环境有助于提高上皮组织的再生能力(Fig.7E)。综上，激活状态下的B细胞，以及组织中IFN-诱导B细胞的含量，在一定程度上干扰着肠粘膜的修复过程。

图7  B细胞抑制了间质-上皮细胞的功能互作

结论

参考文献

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