Nature genetics | 单细胞 空间多组学解析H3-K27M突变驱动胶质瘤细胞状态和空间景观

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2022年12月,美国麻省理工大学Ilon Liu和Mariella G. Filbin教授通过解析H3-K27M突变体弥漫性中线胶质瘤患者的单细胞转录组、表观基因组和空间结构,描述了年龄和解剖位置如何在共同的K27M 驱动突变的条件下塑造胶质瘤细胞的内外特征。

 
 
 
 

文章亮点

 
 
 
 
 

01

用单细胞多组学+空间多组学技术解决了什么问题?

作者利用单细胞多组学和空间多学方法分析H3-K27M DMG的扩展队列,确定了年龄和解剖位置如何根据共同的驱动基因突变塑造胶质瘤细胞的内在和外在特征,这些特征共同决定了常见的K27M突变以及胶质瘤空间和细胞结构的变化。

02

实验亮点

通过单细胞+空间组学技术解释了与年龄相关的微环境因素如何差异地塑造肿瘤细胞状态。

03

临床意义

作者提供了跨空间和时间的H3-K27M DMG细胞异质性的广泛资源,有助于描绘特定时空环境下的细胞特性和微环境生态位之间的多方面相互作用,以设计合理的建模研究和治疗框架。

 
 
 
 
 

研究背景

 
 
 
 
 

由组蛋白3赖氨酸27至蛋氨酸(H3-K27M)突变驱动的弥漫性中线胶质瘤(DMG)是最致命的脑肿瘤之一,发病率在年幼儿童脑干脑桥区域达到峰值。有研究表明脑桥中的前体细胞和早期神经发育窗口作为K27M突变介导的胶质瘤发生的时空相关性。从细胞内在上讲,K27M突变导致广泛的表观遗传失调,从而将发育受限的细胞转变为致瘤性干细胞状态。然而,对于不同中线位置(如丘脑、脑桥或脊髓)以及不同年龄组和呈现出不同形态特征的H3-K27M DMG是否具有相似的细胞组成还不完全清楚。年龄和区域特异性组织环境与H3-K27M DMG的不同临床解剖学特征之间的相互作用及其对肿瘤病理学的贡献仍未得到探索。因此,本研究利用单细胞多组学和空间转录组学方法来分析,进一步解析了H3-K27M DMG细胞群的空间组织,并鉴定了有丝分裂的少突胶质细胞谱系生态位。

 
 
 
 
 

思维导图

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

研究结果

 
 
 
 
 

1、跨时空的H3-K27M DMG细胞图谱构建

作者对50个H3-K27M突变患者肿瘤进行了多组学分析,取脑桥、丘脑、下脑干和脊柱进行scRNA-seq/snRNA-seq(图1a,b)。作者通过CNA分析以及UMAP图展示了H3-K27M DMG细胞组成和按年龄和位置分层的细胞亚群的转录异质性(图1c-d)。

 
 
 
 
 
 

图1 通过单细胞多组学分析的H3-K27M DMG细胞组成

2、不同时空背景下的H3-K27M DMG细胞组成

通过对肿瘤细胞进一步细分得到OPC-like、AC-like、OC-like、Cycling、MES-like(图2a)。其中OPC-like细胞普遍存在于所有肿瘤中,与年龄或位置无关,而MES-like则首次在H3-K27M DMG被检测到(图2a-d)。相同位置和年龄组但不同基因型的原发性胶质瘤的比较支持K27M突变的直接细胞内在效应,使肿瘤细胞偏向胶质/OPC-like而非neuron-like。

利用SCENIC发现了在正常神经胶质细胞中已知的关键基因调控网络(GRN)在H3-K27M DMG肿瘤细胞对应物中同样具有活性,突出了正常发育的神经胶质和肿瘤细胞的相似性(图2e)。通过比较肿瘤位置和年龄组的细胞组成发现,MES-like在成人肿瘤中显著富集,又通过RNA原位杂交进行验证(图2f,2h),并观察到MES-like特征与年龄的关联(图2i),这表明非编码突变和/或非遗传决定因素可能是观察到的年龄特异性的基础。因此,H3-K27M DMG偏向于独立于年龄或中线位置的OPC-like细胞身份,这表明K27M癌组蛋白突变本身的细胞内在效应。

 
 
 
 
 

图2 H3-K27M DMG的肿瘤内转录异质性

3、OPC-like亚群的位置特异性

通过对OPC-like无监督聚类得到3亚群,OPC-like-1表达经典OPC的marker基因,相比之下,OPC-like-2和OPC-like-3细胞表现出前OPC分化状态(图3a-f)。使用scRNA-seq数据集对OPC-like亚群特异性GRN的分析发现,SHOX2和OTX2等TF在OPC-like-1细胞中具有最特异性的活性(图3g)。OPC-like-2细胞特有的GRN包括Notch信号调节因子HES6以及HOX家族的多个图案化TF,OPC-like-3细胞的GRN特征与AP-1 TF家族相关(图3g)。比较OPC-like亚群在时空分层的来源,脑桥中前OPC-like细胞显著富集,OPC-like-1细胞富集在丘脑肿瘤中(图3h)。

 
 
 
 
 

图3 OPC-like细胞的区域特异性状态

4、H3-K27M DMG细胞群的开放染色质景观

作者用8个肿瘤通过10x snATAC-seq来探测单核可及染色质谱,以补充和验证单细胞转录组。结果证明snATAC-seq与scRNA-seq衍生的细胞群基本一致,包括AC-like细胞(图4a,b)。通过将snATAC-seq衍生的可访问染色质区域/峰与scRNA-seq相关联,测量其最接近相关基因的表达水平,确定了顺式调节DNA元件(CRE)及其靶基因的13632个潜在的峰-基因链接(图4c)。其中,287个基因表现出超过8个(前5%)相关的CRE,表示高调控位点复杂性,是关键谱系标记基因的决定因素(图4d,e)。OPC/OC-like细胞特异性预测染色质(GPCs)相关的基因,表明对普遍存在的H3-K27M DMG的少突胶质谱系进行高度合作的调节(图4e),将候选GPC与H3-K27ac ChIP-seq衍生的H3-K27M原发性肿瘤的超级增强子谱叠加,证明了GPC与H3-K27M DMG超级增强子调节基因的显著重叠(图4f)。进一步发现含有SOX8 TF结合位点的16个CRE相连,进一步预测其在OPC-like细胞中具有差异活性(图4g,h)。所有肿瘤细胞状态的GPC的CRE中基因表达,染色质可及性和细胞状态特异性TF富集之间的相互依赖性,例如AC样标记基因ITPKB(图4i)。这些证实了染色质调控和基因表达在多个层面上的紧密交织和细胞状态特异性。

 
 
 
 

图4 H3-K27M DMG细胞群的特征染色质谱

5、H3-K27M DMG中的年龄特异性骨髓细胞景观

本研究通过基因集打分将TAM分为小胶质细胞和巨噬细胞(图5a–c),不同年龄组的小胶质细胞与巨噬细胞比例的比较显示,儿童DMG中的小胶质细胞发生率较高,而成人DMG中巨噬细胞的发生率较高(图5d),肿瘤位置似乎不影响这些比例。在本研究的队列中,与儿童H3-K27M DMG相比,成人MES-like细胞的显著富集,并在成人TAM中检测到更高的OSM表达及相应的受体OSMR(图5e,f),表明免疫介导途径的参与诱导成人肿瘤中的MES-like表型。此外,与儿童TAM相比,观察到成人MES-like标记基因在间充质富集的胶质瘤中表达增加(图5g)。通过分析正常小鼠脑骨髓细胞图谱中跨年龄的基因表达,观察到配体OSM和间充质标志基因随着年龄的增长而增加(图5h),表明H3-K27M DMG肿瘤MES-like状态随年龄的增长与脑髓区室的变化有关,这种变化在正常发育和衰老过程中也发生。

图5 H3-K27M DMG的骨髓细胞景观

6、绘制H3-K27M DMG的单细胞空间结构图

在16个患者H3-K27M DMG组织切片中使用一组从 scRNA-seq 数据集中收集的 116个细胞类型特异性组合标记基因(图6a-c)。通过原位测序(pciSeq)的概率细胞分型分析了空间细胞状态组成,观察到AC-like细胞构成了主要的恶性细胞区室(图6c)。相对于儿童肿瘤,成人H3-K27M DMG切片具有更高比例的MES-like肿瘤细胞(图6d)。恶性细胞邻域的全局分析表明,OPC-like/Cycling 和 OC-like细胞的共定位更高(图6e),通过CODEX(现更名为:PhenoCycler-Fusion)多重免疫荧光(IF)成像验证增殖OPC-like和OC-like细胞的首选为有丝分裂生态位,被更分化的,不增殖的AC-like细胞包围(图6f)。通过计算聚类系数发现AC-like细胞,非恶性星形胶质细胞和TAMs与其他细胞类型/状态聚集的最高趋势,暗示它们更弥漫分布,而不是局限于有限的空间区室(图6g)。因此,在天然肿瘤组织内解析了scRNA-seq定义的H3-K27M DMG细胞群的空间结构,特别是表明存在有丝分裂干样生态位,其中少突胶质细胞谱系的H3-K27M肿瘤细胞(OPC-like和OC-like癌细胞)共定位。

图6 H3-K27M DMG的单细胞空间结构

 
 
 
 
 

结论

 
 
 
 
 

本研究提供了跨空间和时间的H3-K27M DMG细胞异质性的广泛资源,有助于描绘时空环境特定细胞特性和微环境生态位之间的多方面相互作用,以设计合理的建模研究和治疗框架,为这种致命胶质瘤的不同临床解剖学群体量身定制。

 

参考文献:
Liu, I., Jiang, L., Samuelsson, E.R.et al. The landscape of tumor cell states and spatial organization in H3-K27M mutant diffuse midline glioma across age and location. Nat Genet (2022). https://doi.org/10.1038/s41588-022-01236-3

 

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