Adv Sci(IF=17.52) | 郑州大学第一附属医院秦艳茹/香港大学关新元团队多组学技术揭示食管鳞癌转移微环境

食管癌是常见癌症，也是癌症死亡原因。食管癌可分为食管鳞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）两个组织学亚型，其中食管鳞状细胞癌（ESCC）占到八成以上。中国是食管癌发病大国，ESCC占到全球疾病负担的近一半。ESCC患者的预后较差，总体的五年生存率仅为30.3%。

近年来，随着肿瘤微环境研究需求的与日俱增，许多国内研究学者应用单细胞测序，多重免疫荧光等新兴技术对食管癌的肿瘤微环境进行标记，探索与肿瘤预后、疗效、转移等相关的生物标记物，描绘食管癌发生发展的细胞图谱。

食管鳞癌(ESCC)具有高度复杂的肿瘤微环境，淋巴结转移被认为是导致ESCC患者死亡的主要原因。本文分析了4例伴有淋巴结转移的ESCC患者85,263个单细胞转录组数据。通过单细胞转录组数据，观察到了特定免疫细胞和肌成纤维细胞在转移微环境中的出现和增多，以及这些细胞中与预后不好相关基因的高表达。

随后通过PhenoImager多重免疫荧光和免疫组化染色揭示并进一步验证了转移性ESCC微环境的细胞间相互作用与原发肿瘤的差异。这项研究展现了了形成淋巴结转移微环境的潜在分子机制，为药物研究和新治疗方案的开发提供了新的思路：靶向这些非肿瘤的促转移细胞组分，以抑制肿瘤的生长和转移，改善临床预后。

4例ESCC患者样本，9个手术样本包含原发癌组织，癌旁组织，转移淋巴结和肺转移淋巴结。将新鲜的组织进行单细胞转录组建库和测序，对单细胞测序结果进行聚类和细胞注释；根据聚类结果进行细胞亚型标记物鉴定，并分析不同肿瘤微环境中细胞组成差异、拟时分析和相互作用分析。最后对单细胞测序中发现的相关基因，关联TCGA中的ESCC患者数据进行分析，并使用免疫组化和PhenoImager多重免疫荧光进行组织原位验证。

1.正常组织、原发肿瘤组织和转移淋巴结微环境中的细胞构成图谱

研究人员应用单细胞转录组技术在正常组织、原发肿瘤组织和转移淋巴结微环境分别得到1400个基因的单细胞表达数据，并使用UMAP算法进行聚类。结果发现，T细胞是ESCC组织中占比最多的细胞类型群：耗竭型T细胞在原发肿瘤组织中富集；中央记忆型T细胞是无转移淋巴结的主要T细胞类型；而干扰素诱导T细胞只在肿瘤转移淋巴结中被发现。然后，通过TCGA-ESCC中的RNA测序结果验证了其中主要基因与预后的相关性。

研究人员还分析了ESCC患者的B细胞分群结果，发现在原发和转移肿瘤微环境中都发现了更多的FCRL4+IFIT3+记忆型B细胞；而干扰素诱导B细胞只在转移淋巴结中被发现，与干扰素诱导T细胞相同，这预示着干扰素诱导基因的表达在ESCC的淋巴结转移可能发挥重要作用。之后用预后分析的方法找到与预后有关的B细胞亚群。

此外，3个巨噬细胞亚群和1个中性粒细胞亚群作为髓系预后相关细胞类群被发现与更差的临床预后有关。转移肿瘤微环境中含有大量肿瘤相关巨噬细胞，这些巨噬细胞通过分泌趋化因子促进肿瘤的侵袭和转移。
 

通过对肿瘤与非肿瘤组织中成纤维细胞的细胞亚群差异对比，发现两者成纤维组织的异质性，以及高浓度成纤维细胞在肿瘤的进展和转移过程中发挥作用。其中，外膜细胞亚群主要富集在转移淋巴结中，并且高表达THY1, PDGFR𝛽, RGS5 和 NDUFA4L2基因。多重免疫荧光实验同样发现THY1（CD90）+NDUFA4L2+外膜细胞在转移淋巴结中的含量远高于原发肿瘤。

最后，文章还比较了正常组织与转移淋巴结的上皮细胞中的基因表达差异，发现正常组织，恶性上皮细胞以及转移淋巴结中上皮细胞表达特征各不相同。研究人员将本次单细胞测序结果与TCGA-ESCC队列的基因表达谱（GEP）数据进行关联分析，发现CD74, CXCR4和HLA-class II高表达与预后更差相关。
 

2.正常组织、原发肿瘤组织和转移淋巴结微环境中的肿瘤微环境差异

基于单细胞转录组测序结果，研究人员研究了三种组织的微生态差异。与正常组织相比，肿瘤组织中与T细胞和成纤维细胞相关的蛋白数量和浓度更高。对具体的相关基因进行分析可发现，原发肿瘤和转移淋巴结肿瘤微环境的细胞间交流是动态的，并且如要依赖于具有特定功能的重要细胞类型之间的交流（如转移淋巴结中的APOC1+APOE+转移性巨噬细胞和原发肿瘤中的耗竭T细胞等）。

研究人员使用多重免疫荧光技术对原发肿瘤和转移淋巴结的免疫微环境进行检测。其中，APOC1+APOE+巨噬细胞用来定义转移淋巴结区域。在转移淋巴结中更多的APOE+和 APOC1+巨噬细胞与更短的总生存期有关。通过与单细胞测序结果进行关联分析，发现APOC1+APOE+巨噬细胞可能与肿瘤细胞向淋巴结转移相关，它通过一系列免疫识别调节，胶原沉积和对其他代谢通路的调节促进转移的发生。

参考文献

1. Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Esophageal Squamous Cell Carcinoma. Advanced Science. 29 January 2023. 

https://doi.org/10.1002/advs.202204565