J. Biomed. Sci热点 | 空间多组学在肿瘤免疫微环境研究中的应用盘点

　　在过去十年中，单细胞技术逐步阐明了肿瘤免疫微环境在基因组、转录组和蛋白质组水平上的异质性，并进一步加深了我们对肿瘤发展机制的理解。关于肿瘤免疫微环境的空间信息，如细胞的空间位置、细胞-细胞相互作用等，则有待使用空间多组学技术进行进一步挖掘。

　　最近，空间多组学技术已经用于研究几种类型癌症中肿瘤免疫微环境的转录组、蛋白质组和代谢组，从这些方法获得的数据已与免疫组化和多参数分析相结合，以产生癌症进展的标志物。来自台湾中央研究院陳世淯教授团队于22年11月在著名杂志Journal of Biomedical Science上发表了名为Spatial multi-omics analyses of the tumor immune microenvironment的综述文章，回顾了前沿空间组学技术、它们在肿瘤免疫微环境研究中的应用，以及存在的技术挑战。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够分析TIME细胞中的转录组。这些技术对癌细胞、T细胞、髓细胞和间质细胞进行了高分辨率和无偏倚的分析，并阐明了不同肿瘤类型的免疫分布的异质性。肿瘤通常包含多个基因定义的亚克隆细胞，具有不同的基因突变和不同的转录谱。免疫细胞具有祖细胞、活跃细胞、耗竭细胞和抑制细胞的显著不同转录谱，与肿瘤共存。这些数据提出了关键问题：这些功能不同的免疫参与者如何在同一环境中共存？这些细胞是均匀分布在肿瘤块中，还是分离成具有不同空间和生物学特征的类别？为了回答这些问题，研究人员需要结合组织结构信息的单细胞数据集来进行探索。

首先我们需要先了解空间转录组分析最常用的一些方法，空间转录组学的主要策略基于二代测序（NGS）和荧光原位杂交（FISH）。利用NGS技术，在测序之前用位置信息对转录物进行编码。例如，使用10x Genomics Visium平台，包含空间标记的寡核苷酸的芯片用于从覆盖在芯片上的组织中捕获mRNA，然后进行测序处理，产生空间转录组数据。

表1. 空间转录组平台

另一种方法——荧光原位杂交基于成像的策略，将交互式原位杂交或原位测序与高分辨率显微镜相结合，可以实现亚细胞空间分辨率，并能提供全基因组转录组信息。在FISSEQ中，首先让RNA进行逆转录，并接成环状，然后使用特定的DNA聚合酶进行滚环扩增（RCA），在细胞内产生直径为200-400nm的cDNA扩增子纳米球，然后所有形成的扩增子会被相互交联，以保证其空间位置不会在测序过程中发生移动。接下来在测序的每一个循环中对切片进行扫描，就可以将扩增子的序列信息与空间位置相结合，以达到空间转录组测序的目的。

以往人们对于一步染色并检测多种蛋白质的构想极大促进了空间蛋白质组学的多样化发展。目前，大多数蛋白质组学平台使用的标记物或是荧光团，或是金属标签。两种方法在空间分辨率、分子靶标数量和时间动力学等方面都很相似。对于基于荧光的方法，通过循环添加和去除荧光标记的一级抗体，将迭代图像采集的程序应用于感兴趣的FF或FFPE组织。例如：CODEX通过寡核苷酸捕获的方式进行检测，然后利用交换反应进行信号的放大。抗体与具有最小光谱重叠的荧光团、寡核苷酸偶联，在重复检测过程中提供特异性和灵敏度，CODEX的优点是不需要扩增酶或专门的缓冲液，从而降低了成本和时间消耗。

表2. 空间蛋白质组平台

通过对正常组织和癌组织进行空间多组学（基因组、转录组、蛋白质组等）研究，可以揭示不同区域的细胞组成、肿瘤免疫细胞相互作用以及肿瘤进展的相关性的差异（图1）等TIME的各种特征。

图1 空间多组学揭示的TIME图谱

乳腺癌具有很好的组织病理学特征，是空间细胞分析的良好模型。目前已有多个研究团队使用空间转录组学和基于高维抗体的组织分析对这种癌进行探索，例如Wu  et al. 分析了乳腺癌组织细胞类型和肿瘤相关免疫细胞和基质细胞的空间定位；Andersson et al. 使用空间转录组学分析HER2+乳腺癌组织；Keren et al. 利用MIBI进行基于抗体的单细胞蛋白表达扩增，分析了三阴性乳腺癌(TNBC)患者标本中36种蛋白的位置。

另外，也有团队通过空间蛋白组学揭示了其他几种癌症中肿瘤和免疫细胞的分区化。Sheng et al. 使用IMC研究了肝细胞癌（HCC）标本中免疫细胞的拓扑分布；Chan et al. 使用MIBI平台研究了小细胞肺癌（SCLC）样本；Schurch et al. 使用CODEX研究了两种亚型CRC样本中免疫细胞的拓扑结构。

在胆管癌患者肿瘤的空间分辨转录组分析中，Wu et al. 观察到肿瘤核心的T细胞表达的耗竭标记物水平高于肿瘤边界或肿瘤周围正常组织的T细胞。作者在最近未发表的B细胞淋巴瘤小鼠模型CODEX分析中也检测到了相同的特征与现象。

肿瘤细胞与免疫细胞交界的侵袭前沿通常是免疫反应活跃的区域。Andersen et al. 发表的一项乳腺癌空间转录组学分层分析研究以及Keren et al. 对TNBC进行的空间蛋白质组学研究均发现肿瘤免疫边界的免疫细胞浸润与更好的预后相关。

Stereo-seq技术对HCC和肝内胆管癌（ICC）肿瘤的研究发现在侵袭性肿瘤前沿有一个独特的微环境，比如NK细胞、T细胞和巨噬细胞会聚集在肿瘤和正常组织之间的边界附近。这种抗炎性的巨噬细胞募集可能会促进癌细胞侵入正常组织，使预后恶化。

肿瘤相关基质细胞和纤维细胞成分是异质的，在肿瘤组织中具有相关的空间分布。结合scRNA-seq和空间转录组学，Moncada et al. 研究了胰腺导管腺癌组织切片中这些细胞类型的细胞分布和功能状态，确定了一个与成纤维细胞高度相关的癌细胞簇。空间转录组学数据还表明，M1免疫巨噬细胞与癌细胞亚群相关，该亚群富含应激反应基因并与免疫成纤维细胞相关。

有研究团队使用空间转录组学结合scRNA-seq绘制了乳腺癌中癌相关的成纤维细胞（CAF）图谱。CAF长期以来被认为是对抗肿瘤抗原的免疫调节细胞。空间转录组数据分析揭示了炎症 CAF和相邻T细胞之间强烈的趋化因子、补体途径和TGFβ介导的串扰。

Risom et al.利用MIBI分析了从早期DCIS到浸润性乳腺癌的基质成分演变，发现没有进展的DCIS展现的特征是成纤维细胞较少和肌上皮细胞不连续。在进展为侵袭性癌症的肿瘤样本中，DCIS与活跃的成纤维细胞、纤维形成和肌上皮细胞缺失相关。此外，肌上皮的 E-Cadherin表达及其在肿瘤周围的连续性与肿瘤恶性程度高度相关。

三级淋巴结构（TLS）是将肿瘤抗原呈递给 T 细胞的位置。由于淋巴结构具有异质性，如果没有多重免疫染色和转录组学技术，肿瘤相关TLS的鉴定可能相当困难。TLS 包含多种具有不同功能的免疫细胞。空间分析可以识别具有这些结构特征的B细胞、T细胞和树突状细胞的聚集体。

与其他多组学方法一样，空间转录组学结合scRNA-seq的方法有助于发现新的肿瘤生物标志物。下面这个案例证实了这个方法所拥有的巨大潜力：Gouin et al. 使用scRNA-seq、空间转录组学方法和CODEX研究了25名肌肉浸润性膀胱癌患者的样本，他们从单细胞聚类数据中，发现了一种新的生物标志物N-Cadherin 2（由CDH12编码），提示癌上皮细胞簇与干细胞样特征和不良预后相关。空间转录组学和 CODEX 的细胞邻域分析均表明，表达 CDH12 的癌细胞附近的T细胞表达了更多的衰竭标记。这些发现后续也得到其他类型癌症数据的支持，表明具有更多去分化、更多增殖和更具侵袭性特征的肿瘤细胞，通常与耗竭T细胞的原位相关。

通过空间多组学方法也可以对转移性肿瘤细胞和免疫细胞的空间相互作用进行更深入的探索。例如：Wu et al. 使用空间转录组学和多重IHC研究了CRC的肝转移；Sudmeier et al. 研究了实体瘤脑转移的T细胞景观等。

为了理解组织中的拓扑细胞相互作用模式，可以通过对高维多组学数据进行计算分析，来确定特定类型细胞位置之间的相关性，某些细胞协调模式与各种癌症患者的生存或预后有关。 

TIME的空间拓扑也与总体生存相关，肿瘤免疫结构的分区通常与更好的生存呈正相关。Colombo et al. 的研究表明，与分散亚型相比，更结构化的生发中心B细胞亚型与更好的总体生存率相关。在CRC中，CLR亚型的肿瘤比DII亚型患者的肿瘤具有更多的分区，分区的存在与患者预后具有统计学相关性。在乳腺癌肿瘤中也观察到这种现象，其中分区评分与总生存率高度相关。在另一个例子中，Andersson et al. 根据B细胞和T细胞的共定位程度定义了乳腺癌标本的TLS评分，并发现较高的TLS评分也与更好的总体生存率相关。

空间组学技术的发展使得在癌症进展过程中评估细胞亚群的空间分布、细胞特征和肿瘤不同区域间的代谢成为可能。例如在HCC患者中，Sheng et al. 的研究发现去分化、增殖和免疫检查点标记物的水平和位置在肿瘤发生过程中发生了变化。在CRC组织中，Hartmann et al. 观察到免疫细胞向肿瘤免疫边界的代谢极化，CD98和ASCT2的表达增加。CD98和ASCT2是在人类癌症中具有预后价值的转运蛋白。

此外，通过对空间结构数据集的多维解构，可以识别肿瘤进展中的关键基因。Risom et al. 的研究获得了DCIS和浸润性乳腺癌（IBC）样本以及正常乳腺组织的MIBI数据，并提取了从DCIS到IBC过程中的前20个最重要特征，空间分析表明侵袭性进展取决于多种细胞类型的空间分布演变，而不是单个细胞亚群水平或分布的改变。

使用空间多组学工具的研究揭示了时间的复杂性，并表明除了细胞组成外，肿瘤微环境中细胞类型的相对位置和相互作用强烈影响肿瘤的发展。对空间相互作用的更好理解正在推动对肿瘤亚型的重新定义，并将研究重点转移到肿瘤免疫相互作用单元，发现更多的细胞类型，以及随着癌症进展检查时间间隔的变化。

在过去十年中，空间组学的发展导致了个性化、精确医学的发展。精准医疗是为每个患者量身定制的治疗策略，它严重依赖于详细的患者数据。由于技术进步，科学家现在能够在高数据维度的单细胞水平上分析肿瘤组织。本文中描述的空间多组学工具揭示了肿瘤微环境中肿瘤和免疫细胞的异质组成。这些方法使我们能够全面探索癌症，并进一步了解肿瘤进展的潜在机制，这对治疗和反应至关重要。未来，随着强大的自动化平台的搭建，临床医生和病理学家应该能够评估疾病进展，并为每个患者量身定制治疗方案，使我们更接近精准医学的目标。

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