Sci Adv | PhenoCycler 52个超多蛋白靶标建立溃疡性肠炎空间图谱，发现预测患者治疗响应性指标

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）研究领域又有新进展！近日，斯坦福医学院的Stephan Rogalla研究团队在《Science Advances》（IF=14.957）杂志上发表了题为“溃疡性结肠炎组织图谱揭示疾病驱动的炎症细胞类型及其对 TNF 抑制剂治疗耐药性的性别差异（A tissue atlas of ulcerative colitis revealing evidence of sex-dependent differences in disease-driving inflammatory cell types and resistance to TNF inhibitor therapy ）”的文章，作者通过对UC患者临床活检样本的52个蛋白标志物成像+空间邻域分析，建立了UC组织微环境的空间图谱并总结了TNF抑制剂治疗导致炎症细胞邻域变化的规律，进而给出通过空间蛋白组学方法进行UC患者治疗响应程度预测的建议方案[1]。

溃疡性结肠炎（UC）是一种非特异性的慢性炎症肠病（IBD），多发于直肠和结肠组织。UC发病多见于青壮年，各年龄段患者男女比例接近。虽然UC的病因尚未明确，但遗传、免疫和肠道菌群失调等被认为在UC的初发和复发过程中发挥关键作用。临床数据表明，UC患者不仅生活质量受到影响，其结直肠癌风险也会大幅提升。

UC患者临床病情严重程度的评价采用Mayo评分体系，根据总分范围从0到12（排便次数、便血情况、内镜情况和医生评价分别评分）将患者分为Mayo评级0-3级，分数/评级越高表示患者病情越严重。Mayo评级在2级以下的UC患者一般针对其临床症状采用控制炎症反应的药物治疗；Mayo评级 3级的患者则可能需要采用手术治疗。近年来，UC的治疗手段从免疫抑制单一疗法（如皮质类固醇和硫唑嘌呤）发展到更有针对性的免疫调节药物精准医疗方案。

肿瘤坏死因子（TNF）抑制剂如英夫利昔单抗（infliximab）和阿达木单抗（adalimumab）可以有效缓解UC患者临床症状并降低需要手术治疗的患者比例。然而，临床上有13%-40%的UC患者对TNF抑制剂治疗无响应。同时，TNF抑制剂治疗后的12个月内，高达46%的患者发生了药物反应性丧失或出现不良反应。目前现有的伴随诊断技术无法对TNF抑制剂的治疗效果进行预测，因此针对UC患者治疗方案的预测性生物标志物成为精准医疗需要攻克的难题。

单细胞空间组学技术能反应出样本组织内各个细胞亚群的活化状态及其在空间上的相互作用关系，为深入分析诸如UC病理样本这种高度异质性的组织提供了强有力的手段。已有研究表明，通过空间分析手段（如细胞邻域分析）不仅能客观找出不同病理状态下患者组织样本间的细胞分布差异，还能通过细胞亚群之间空间分布的差异情况预测患者对特定治疗手段的适应性[2]。本文作者就是从UC患者病理样本的单细胞空间蛋白组学分析展开研究的。

本研究收集了42个活检组织块样本（取自29例UC患者和5例健康对照），利用PhenoCycler（原CODEX）单细胞空间组学分析系统收集了新鲜冰冻样本中合计1,710,973个单细胞数据（52个蛋白生物标志物检测体系，图1）。随后，通过细胞特异性标志物分析，确定了13个细胞亚群并建立了样本炎症微环境的单细胞空间图谱（single cell special atlas），实现了组织样本中细胞比例和功能性标志物表达差异的图像可视化（参考图2D和图4A）。通过细胞邻域分析找出UC样本中的10个细胞邻域并找出与TNF抑制剂治疗响应相关的细胞邻域。

图1 UC活检样本的处理和空间蛋白组检测示意图

为了更清楚地表征UC患者组织炎症微环境的状态，作者首先利用PhenoCycler技术实现了新鲜冰冻活检样本52个蛋白标志物检测体系，并完成UC样本的细胞亚群分类（图2D-E，抗体信息详见原文补充数据Table S2）：B细胞、T细胞、上皮细胞、粒细胞、平滑肌细胞、间质细胞（Mixed stroma）、树突细胞（DC）、浆细胞、滤泡T细胞（Follicular T cell）、增殖性上皮细胞（Proliferative epithelium）、中性粒细胞、上皮浸润性T细胞（Intraepithelial T cell）和管壁细胞（Vessels）。

在此基础上，作者通过分析发现，UC患者的Mayo评分与T细胞、上皮细胞、浆细胞、粒细胞、DC和上皮浸润性T细胞的组织浸润情况显著正相关（图2F）。随后，作者建立了UC样本的空间细胞亚型分析体系以便进一步对比样本间细胞亚群的空间分布差异（图2G-I）。

图2 建立UC炎症微环境的单细胞空间图谱

为了更深入地解读不同分级UC患者样本之间的异质性，作者进行了细胞空间聚集情况的聚类分析和细胞-细胞间接触频率分析（图3A-C）。结果表明，虽然这些分析能有效表征样本内部组织结构和细胞比例变化（区分上皮组织区、天然免疫反应区和获得性免疫反应区），但并不能体现出UC患者Mayo评分等级。作者进而采用了细胞邻域分析方法，将分析的最小单位从单个细胞转移到每10个细胞组成的细胞邻域（CN）上。在UC患者样本中，分析系统检测到10个不同的细胞邻域，每个邻域都有相对保守的细胞亚群募集规律（图3D）。

在此分析中，作者发现CN1和CN8与患者Mayo评分呈负相关；CN3、CN4、CN5则与患者Mayo评分呈正相关。有趣的是，CN2（淋巴细胞聚集邻域）随着患者病情加重比例呈现先升高后下降趋势，且在Mayo评级2级时达到最高比例（详见原文结果）。另外，作者分析功能性标志物（TNFR2、PD1等）在不同细胞邻域中的表达情况，进一步验证了细胞邻域分析对免疫细胞功能预测的准确性（图3G和3I）。

图3 UC患者炎症微环境空间邻域分析

有了UC患者的空间单细胞图谱和细胞邻域分析体系后，作者在接受TNF抑制剂疗法患者样本、未接受TNF抑制剂疗法样本和对照组样本之间进行数据回溯分析，尝试找到能预测TNF抑制剂响应程度的关键指标。作者在空间细胞图谱中发现HLA-DR在B细胞和T细胞中表达下调（对比了TNF抑制剂治疗组患者和非治疗组患者样本中CD152、Ki67、CD126、CD134、HLA-DR、CD69等标志物，图4A-B），以及淋巴细胞聚集邻域CN2和B细胞-滤泡T细胞邻域CN9比例下降（图4H）。作者还发现，在女性患者中，淋巴细胞比例、募集水平和CN2比例均高于男性患者（详见原文结果），提示女性患者对TNF抑制剂疗法有更高的响应率。

最终，作者将这些参数作为TNF抑制剂响应预测的潜在指标，并给出了UC样本PhenoCycler检测自动化AI分析方案的建议。

图4 TNF抑制剂疗法导致细胞邻域变化

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