Nat Commun.| 清华大学携手协和医学院肿瘤医院应用单细胞转录组测序联合多重荧光免疫组化技术发现胃癌中T细胞耗竭新路径

相关研究已经证明，胃癌的免疫微环境已经被证实对肿瘤的控制发挥着重要作用，但胃癌肿瘤微环境的特征仍没有被详细的描述。该项研究通过分析对10名胃癌患者的166,533个肿瘤、癌旁和血液细胞单细胞转录组测序结果，发现了肿瘤相关基质细胞(TASCs)通过上调wnt通路和血管生成，对患者生存期造成了不良影响。肿瘤相关巨噬细胞和LAMP3+ DC细胞参与调解T细胞活性，并与TASCs形成互动集群。由组织残留记忆T细胞起源的Tc17细胞能够随后分化成耗竭型T细胞，暗示一种新的耗竭型T细胞生成轨迹，并对以上结果通过PhenoImager多重荧光免疫组化技术进行了验证。

1. scRNA-Seq展现胃癌的肿瘤微环境图谱

研究首先利用scRNA-seq研究胃癌肿瘤微环境，从10名具有匹配的癌组织和癌旁正常组织及血液的胃癌患者中生成了166533个细胞图谱。scRNA-seq图谱被分为12个广泛的免疫细胞、基质细胞和上皮细胞。结合scRNA-seq分析，最终生成了配对的TCR和BCR (T/B细胞受体)测序数据，以研究不同T/B细胞亚型内的状态转换。

2. 胃癌中的恶性细胞展现出广泛异质性

对细胞中的上皮细胞进行了抽取和重聚类，通过肿瘤分数计算，CNV以及对比WES数据中的肿瘤特征性基因对肿瘤细胞和正常细胞进行了区分。将上皮细胞分为正常细胞簇，肿瘤细胞簇，肠化生细胞簇和不确定细胞簇。通过对肿瘤细胞簇进行分析发现，不同的肿瘤细胞簇可能暗示着肿瘤的不同发展阶段。

3. 胃癌中的基质组分经历了重大重构

研究发现肿瘤组织中的基质细胞发生了显著的转变。胃中的内皮细胞表达MHC II型基因如HLA-DRA和HLR-DRB5，多重荧光免疫组化实验同样证实了这一现象。

研究还显示，成纤维细胞和内皮细胞均表达FAP，一种肿瘤相关成纤维细胞标记（CAF），并表达其他CAF和炎症相关成纤维细胞标记。肿瘤相关基质细胞(TASCs)表现出Wnt信号和血管生成活性上调，并与生存率呈负相关，显示广泛的促肿瘤特征。

4. 脂质相关巨噬细胞在肿瘤中富集

研究人员将单细胞测序结果中的髓系细胞聚类成8个亚型，其中Mφ_APOE细胞簇主要分布在肿瘤组织中，多重荧光免疫组化实验同样证实了这一现象。脂质相关基因(APOE, TREM2)和溶酶体相关基因(GRN, CD63, LAMP1)均再Mφ_APOE细胞簇中表达上调，在肿瘤中表达量更高。脂质和溶酶体相关功能调节异常是胃癌中的肿瘤相关巨噬细胞的典型特征。

此外，研究人员还发现了除了3个常见的DC细胞亚型，还发现了一种命名为DC_LAMP3不常见的DC细胞亚型，这种亚型的DC细胞能够促进肿瘤细胞向淋巴结迁移。肿瘤相关的巨噬细胞和LAMP3 + DCs参与介导T细胞活性，并与TASCs形成细胞间相互作用枢纽。细胞间通信分析表明，TASCs、TAMs和LAMP3+DCs是TME中复杂细胞相互作用的关键介质。

5. Tc17和 Th17细胞通过IL17/22/26信号通路促进肿瘤生长，驻留型CD8+ T通过Tc17细胞作用成为耗竭型

通过对单细胞测序结果中的T细胞进行提取和重聚类，发现CD8_C8_IL17A细胞型在胃癌肿瘤免疫微环境中与Th17（IL-17+ CD4+T）细胞可能在功能上有重叠，被命名为Tc17(IL-17+ CD8+ T)细胞。

Tc17细胞广泛存在于胃癌组织中，研究人员对其进行克隆型与轨迹分析，发现Tc17细胞起源于组织驻留记忆T细胞，CD8_C8 (Tc17)和CD8_C3 (细胞毒性T细胞)一样可能是潜在的耗竭型CD8+T细胞的来源，这可能是一种新的T细胞耗竭途径。随后研究还发现，IL17 +细胞可能通过IL17、IL22和IL26信号通路来促进肿瘤进展。通过对比细胞毒性T细胞与Tc17细胞，发现两者的调控模式和耗竭轨迹完全不同。对单细胞测序结果中的T细胞进行提取和重聚类，发现CD8_C8_IL17A细胞型在胃癌肿瘤免疫微环境中与Th17（IL-17+ CD4+T）细胞可能在功能上有重叠，被命名为Tc17(IL-17+ CD8+ T)细胞。

6. 肿瘤相关基质细胞和髓系细胞是胃癌TME中细胞相互作用复合物的关键调节因素

通过单细胞测序结果推测肿瘤组织与正常组织中的细胞与细胞间相互作用，包含肿瘤相关基质细胞（TASC）和巨噬细胞的细胞间相互作用在胃癌组织中占主导地位。研究表明，髓系细胞群能够通过复合L-R相互作用调节淋巴细胞，基质细胞也可以通过接触-独立机制抑制淋巴细胞活性。

该研究通过PhenoImager多重荧光免疫组化技术多次验证了单细胞测序中的重要发现，并通过多重荧光免疫组化结果中的空间位置信息，为关注的细胞类型之间的相互作用提供了有力证据。本文构建了一个庞大且复杂的胃癌细胞图谱，并通过生物信息的方法推测了不同细胞之间的相互作用与相关性，发现了IL17+ T或它前肿瘤信号(IL17/22/26)可作为IL17+胃癌的潜在治疗靶标。单细胞测序结合多重荧光免疫组化技术联合呈现的研究结果，为肿瘤免疫微环境研究提供了多组学多角度的结果呈现。

多重荧光免疫组化技术提供了单细胞测序结果中所缺乏的空间原位信息。这种联用被很多研究所采用，逐渐成为一种多组学研究的常用方案。

参考文献

1.scRNA-seq of gastric tumor shows complex intercellular interaction with an alternative T cell exhaustion trajectory. Nat Commun. volume 13 (2022)