J. Infect. (IF=28.2) | 单细胞测序联合多重免疫荧光绘制结核感染肺组织图谱

肺结核(pulrnonary tuberculosis)俗称肺痨，是由结核分枝杆菌感染人体肺部引起的一种慢性传染病, 是结核病中最常见的一种。肺结核是我国发病、死亡人数最多的重大传染病之一。目前我国仍是全球30个结核病高负担国家之一。一直以来，我们对肺结核的研究主要集中在人群调查，预防免疫，耐药管理等，而对结核杆菌感染后的生物学基础研究相对较少。

2023年9月，上海公共卫生临床中心研究团队在《Journal of Infection》（IF=28.2）杂志上发表研究文章“Single-cell RNA-sequencing reveals heterogeneity and intercellular crosstalk in human tuberculosis lung”。该研究选择了18F-FDG肺部炎症活跃区域，代表结核感染严重区域。选取六个患者，取18F-FDG活跃区域与相邻区域组织，进行单细胞测序，研究不同样本中免疫细胞与非免疫细胞的构成，以及他们的转录变化和相互之间的信号调节。并通过多重免疫荧光研究这些细胞在组织原位上的空间分布和相互作用。

1. 患者入组

研究人员选取6名肺部切除手术患者，患者符合以下要求：(1)定期治疗痰液连续阳性或反复阳性的局部病变；(2)存在结核腔、肺破坏等可引起痰阴性结核复发；(3)结核性支气管炎、管性胸膜瘘、脓肿、咯血或其他恶性症状；(4)无心、脑血管、高血压、糖尿病等手术禁忌症。

2. 细胞测序

取患者18F-FDG活跃区域与相邻区域组织，进行单细胞测序，研究不同样本中免疫细胞与非免疫细胞的构成，以及他们的转录变化和相互之间的信号调节。

3. 多重免疫荧光染色

使用Opal多重免疫荧光染色试剂对组织切片进行IL4I1，CD4，FOXP3，CD68多靶标染色，并使用PhenoImager HT进行全片成像。

1. 结核肺组织的细胞图谱

单细胞测序结果显示，在组织中共鉴定出29个免疫细胞和实质细胞亚群。在免疫细胞中，定义了多个髓系细胞亚群：3个肺泡巨噬细胞、3个单核细胞衍生的肺泡巨噬细胞、2个单核细胞亚群和3个树突状细胞亚群；5个T和NK亚群：两个CD4，一个CD8，两个NK细胞；B细胞，浆细胞亚群；还有肥大细胞。非免疫细胞被鉴定为内皮细胞和5种上皮细胞类型：AT1、AT2、棒状细胞、纤毛细胞和分泌细胞。

2. 18F-FDG丰度和结核感染程度与细胞组成和转录情况的差异变化

与健康肺组织数据相比，结核感染后的肺组织中多种免疫细胞类型出现了上调或下调。同时，18F-FDG活跃区域出现了广泛的细胞特异性转录变化。通过对高18F-FDG富集区域（HIGH）、低18F-FDG富集区（LOW）、高和低18F-FDG富集区(TB)和阴性对照(DONOR)的两两比较，确定细胞类型特异性差异表达基因。与未感染的阴性对照肺相比，具有高和/或低18F-FDG富集(结核病诱导)的结核感染肺在髓系和淋巴系细胞群中显示干扰素刺激基因的表达增加。

3. 确定与结核病进展和疾病相关基因表达的细胞类型

将结核感染的肺与未感染的肺进行比较，无论18F-FDG的高或低，在淋巴亚群中的Treg和CD4以及骨髓亚群中的LGMN-MΦ， AREG-MΦ， CD163-MΦ， LAMP3-DC和cDC中观察到结核风险基因。免疫代谢特征基因LAP3和WARS的上调仅局限于髓系亚群：LGMN-MΦ、AREG-MΦ、CD163-MΦ和cDC。

4.  细胞间相互作用网络

为了确定免疫抑制性髓系细胞和T细胞在结核病肺中的细胞间和分子相互作用网络，使用CellPhoneDB分析来鉴定来自结核病和供体组织的细胞簇之间的配体-受体相互作用。观察到表达IL4I1的髓系细胞(LAMP3-DC、AREG-MΦ、LGMN-MΦ和cDC)与Treg、CD8或CD4细胞通过免疫抑制、共刺激分子或趋化因子之间的细胞间相互作用。研究人员采用多重免疫荧光技术对结核感染肺组织进行描绘，研究这些细胞在组织原位的空间分布。

在结核病肺中观察到Treg和CD8 T细胞之间潜在的配体-受体相互作用，涉及趋化因子(CCL4_CCR8和CCL5_CCR4)、粘附连接(SELPLG_SELL)和免疫调节(LTA_TNFRSF14和TNF_FAS)。这些相互作用在肿瘤微环境中被深入研究，他们促进Treg的免疫抑制活性和CD8 T细胞的衰竭。

本文采用单细胞测序结合多重免疫荧光技术对结核杆菌感染引起的肺结核患者的肺组织进行了细胞图谱的绘制。发现了结核严重感染的肺组织中，相对于健康肺组织中细胞构成的变化，以及这些细胞的表达调控情况。

目前，单细胞测序被广泛应用于多种疾病的图谱绘制和机制研究，它在细胞分类和细胞转录及其所代表的细胞状态研究方面具有优势。但是，单细胞测序缺乏组织原位信息，无法预测和观察这些细胞在组织原位是否按照转录本显示的状态来表达，也无法观察到这些细胞在组织原位的分布状态。Akoya Biociences的PhenoImager 多重免疫荧光技术所带来的全景单细胞组织原位多靶标表达结果解决了这一问题，为研究者们的单细胞测序研究成果提供了有力的印证。

参考文献

1. Single-cell RNA-sequencing reveals heterogeneity and intercellular crosstalk in human tuberculosis lungJournal of Infection. Vol 87, Issue 5, P373-384, Nov2023. DOI:https://doi.org/10.1016/j.jinf.2023.09.004