Nat. Biomed. Eng. (IF 28.1) | 3D类器官 多重荧光免疫组化用于双特异性抗体的安全性评估

2023年12月，来自罗氏制药公司人类生物学研究所（Institute of Human Biology, IHB）、巴黎萨克雷大学和巴塞尔大学合作的研究团队在《Nature Biomedical Engineering》（IF=28.1）期刊发表题为“Analysis of off-tumour toxicities of T-cell-engaging bispecific antibodies via donor-matched intestinal organoids and tumouroids”的研究文章。该研究利用患者来源的肠道类器官和肿瘤类器官模型，通过多重荧光免疫组化（mIHC）技术研究T细胞双特异性抗体（T-cell-engaging bispecifc antibodies，TCBs）的肿瘤外脱靶毒性及其机制，发现传统临床前毒理学模型无法预测的药物毒性，以及TCB治疗响应的病人间差异。

癌症免疫疗法招募免疫细胞靶向肿瘤，已成为对抗癌症最有前途的策略之一。尽管取得了惊人的临床成功，然而只有一小部分患者对治疗有反应。除了抗肿瘤疗效的差异外，免疫相关毒性是癌症免疫治疗药物临床转化的主要障碍。几乎所有T细胞靶向治疗（包括免疫检查点抑制剂、CAR-T细胞治疗和T细胞双特异性抗体）的巨大临床潜力都受限于健康组织中的脱靶毒性，最终导致严重的不良反应，通过传统的临床前毒理学模型可能无法有效预测。

患者来源的类器官源自原代健康组织或肿瘤组织样本形成的3D体外培养结构，由于它们能够保留供体组织的形态、遗传和功能特征，因此正在逐渐成为强大的临床前模型。类器官在肿瘤学研究和个性化医疗中的价值之一在于可以准确预测患者对抗癌药物的反应，从而指导患者个性化的精准治疗。然而，基于类器官的免疫肿瘤学模型在很大程度上忽视了癌症免疫疗法在健康组织中的毒性，这是这些药物有效临床转化的主要障碍。

在本研究中，研究团队使用T细胞双特异性抗体（TCBs）疗法，采用健康肠道组织来源的类器官来评估癌症免疫治疗药物的安全性。研究结果表明类器官-免疫细胞共培养体系能够捕获动物模型忽略的临床毒性，并阐明支撑这些效应的细胞机制。在匹配的健康组织类器官和肿瘤类器官中进行联合疗效和安全性研究，辅以多重荧光免疫组化（mIHC）技术，为抗肿瘤免疫应答过程中细胞互作介导的肿瘤细胞杀伤及免疫介导的健康组织损伤提供了临床相关的重要见解。

1. 建立含有免疫细胞的健康肠道或肿瘤类器官共培养3D模型

T细胞双特异性抗体（TCBs）可识别两种不同的表位：癌症抗原和CD3 T细胞受体。然而，靶抗原常常也表达于健康器官中，导致肿瘤外T细胞活化对表达靶标的健康组织的损害。例如，靶向上皮细胞粘附分子（EpCAM）和癌胚抗原（CEA）的TCBs被开发用于治疗实体瘤，但在I期临床试验中发现会引发腹泻的不良反应，这表明靶向肿瘤外肠道反应性，这些效应并未被临床前体外和动物模型所发现。

本研究首先关注患者来源的肠道类器官是否可建立由EpCAM TCB引发的临床毒性，以及正在开发的CEA靶向TCB的模型毒性。首先从患者手术切除的健康组织边缘制备小肠和结肠类器官，然后用免疫组化表征小肠和结肠类器官的组织起源，并评估CEA和EpCAM在类器官中的表达，并将其与供体肠道样本进行比较。考虑到TCBs同时作用于上皮细胞和免疫细胞来发挥作用，研究人员在肠道类器官培养中加入异体外周血单核细胞（PBMCs），再给予EpCAM TCB处理，通过Caspase-3/7诱导表达监测免疫介导的上皮肿瘤细胞凋亡。

该模型显示，所有上皮靶向TCBs都能作用于类器官，对靶点表达和抗体亲和力等参数敏感，且与临床报告一致。以上数据表明，类器官可为TCB介导的健康器官毒性建模提供一个强大而敏感的体系。

图1：患者来源的肠道类器官与 PBMC 共培养，概括了生理靶标表达模式，从而实现了 TCBs 诱导的靶向肿瘤毒性的“反向翻译”

2. TCBs脱靶毒性的作用机制

本研究中类器官模型的一个优势是，在生理相关的ECM包埋肿瘤上皮的背景下跟踪TCB给药后免疫反应的演变。通过流式细胞分析对给药后不同时间点收集的类器官-PBMC共培养体系进行表型评估，以获取不同TCB处理后免疫细胞动力学表征。总体而言，免疫反应的幅度与预期的靶抗原结合程度相关，TCB诱导的肠道靶向动力学与临床试验数据中报告的患者安全性一致，证明了该模型的实用性及其对TCB剂量、抗原亲和力和靶点可及性的敏感性。

尽管流式细胞表型分析为阐述驱动TCB相关肠道毒性的免疫机制提供了有价值的见解，但没有提供关于上皮和免疫区室内部和之间的空间相互作用的信息。为了以时空解析的方式分析TBS介导的免疫激活，研究团队通过7色多重荧光免疫组化（mIHC）来对Pan-CK+上皮细胞、Caspase-3/7+凋亡细胞、CD4+/CD8+ T细胞、CD20+ B细胞和CD14+单核细胞进行原位可视化成像，并对这些标志物进行定量分析。与实时活细胞成像结果一致的是，通过多重荧光免疫组化（mIHC）也观察到TCB给药后类器官内caspase信号随时间的增加，同时伴有肿瘤上皮坏死。mIHC方法还揭示了微妙的类器官和免疫细胞相互作用。

图2：通过多重荧光免疫组化技术解析TCB介导的肠道类器官毒性中免疫-上皮相互作用

如上图所示，在TCB对照组中，CD4+和CD8+ T淋巴细胞呈现小而圆的静息状态，而EpCAM TCB刺激的免疫细胞变成更大的椭圆形或不规则性，并向上皮区域广泛迁移，在实验结束时类器官已完全被免疫细胞浸润。

此外，观察到类器官上皮细胞之间有T细胞浸润，类似于肠屏障上皮内淋巴细胞的整合（左下角放大插图）。这一过程似乎先于细胞凋亡的诱导，因此可能是最终导致类器官死亡的相互级联作用的重要步骤。这些观察结果也与TCB治疗后出现严重腹泻的患者中肠道免疫细胞浸润的报告相一致。

3.通过类器官模型进行TCB的有效性-安全性联合分析

将药物的安全性与疗效数据结合在一起对于潜在药物的临床转化是非常有意义的。因此，研究团队使用供体匹配的健康组织类器官和结直肠癌类器官同时评估肿瘤杀伤和肠道毒性，以扩展基于3D类器官的药物评估系统。

在进行功能研究之前，首先使用H&E和IHC染色评估类器官和肿瘤类器官，以确保能模拟各自原生组织的结构、细胞组成和靶标表达。然后使用多重荧光免疫组化技术来分析TBC处理的肠道类器官和肿瘤类器官中的上皮损伤、免疫细胞激活和其他行为（详见下图）。

图3：TCB效应的联合有效性-安全性分析揭示了健康和肿瘤类器官内免疫细胞结合差异

尽管肿瘤类器官中靶标表达水平更高，但在健康肠道类器官共培养体系中免疫浸润和上皮细胞裂解更显著。肠道类器官在给药后72小时被彻底破坏，但肿瘤类器官依然保留了完整的核心结构。为了阐明这一发现背后的细胞机制，研究人员定量分析了T细胞在各个类器官区域的时空动态，结果发现肠道类器官和肿瘤类器官对T细胞浸润的敏感性有显著差异。CD4+和CD8+淋巴细胞在健康类器官上皮内的整合比肿瘤类器官内更快速和广泛，而肿瘤类器官样本中的T细胞大部分被隔离在上皮的基底侧。

4. 3D类器官模型在精准医疗中的应用

接下来，研究人员关注3D类器官是否可以反映不同患者对癌症免疫治疗反应的易感性（脱靶毒性），以考察其在精准医疗应用中的效用。为此，研究人员采用来自不同患者的活检组织建立了14个小肠和结肠类器官细胞系，然后用EpCAM和CEA TCB处理与PBMC共培养的各个类器官。TCB介导的类器官杀伤定量分析揭示了类器官队列中治疗响应的实质性差异。EpCAM和CEA TCB的毒性结果与靶标丰度呈正相关，表明靶标表达是不良事件的主要决定因素和潜在预测因素，但也有例外案例表明靶标丰度并不是控制类器官杀伤的唯一因素。此外，不同供体的PBMC如何影响结局也很重要。通过多重荧光免疫组化技术发现严重受损的类器官细胞也有大量CD4+和CD8+ T细胞广泛浸润。

综上，靶标丰度、肠道区域和其他供体特异性因素似乎都有助于确定TCB治疗对肠道类器官的功能影响。进一步剖析这些反应差异背后的机制，并可利用它们作为预测或减少与癌症免疫治疗药物相关的免疫相关毒性的标志。

患者来源的类器官模型揭示了TCBs安全性的供体依赖性差异，这可能归因于患者之间靶标表达的差异。本研究提出的与患者相关的基于3D类器官的免疫疗法临床前安全性和有效性测试通用模型，有助于理解和利用免疫触发的上皮细胞杀伤基本机制，助力癌症免疫疗法的临床前和临床开发，并指导免疫肿瘤药物临床应用的优化。

参考文献

1. Harter MF, Recaldin T, Gerard R, et al. Analysis of off-tumour toxicities of T-cell-engaging bispecific antibodies via donor-matched intestinal organoids and tumouroids. Nat Biomed Eng. Published online December 19, 2023. doi:10.1038/s41551-023-01156-5

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