Visium空间基因表达解决方案助力《Cell》文章发表！

文章名称：Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma

发表期刊：Cell

发表时间：2020年7月

影响因子：36.216

文章摘要

本文的研究对象是皮肤鳞状细胞癌（cSCC），结合10xGenomics单细胞转录组测序和Visium空间基因表达解决方案，研究了人cSCC和配对的正常皮肤。发现cSCC有四个肿瘤细胞亚群，三个涵盖正常表皮状态的亚群，一个定位于纤维血管微环境的肿瘤特异性角质形成细胞亚群（TSK）。将单细胞和空间数据映射的配体-受体网络与特定细胞类型整合，揭示TSK是细胞间通讯的枢纽。观察到免疫抑制的多种特征，包括T调节细胞（Treg）与CD8 T细胞共定位于分隔的肿瘤基质中。最后，人类肿瘤异种移植物的单细胞表征和体内CRISPR筛选鉴定了肿瘤发生中起关键作用的特定肿瘤亚群富集基因网络。本研究分析了cSCC肿瘤和基质细胞亚群，它们相互作用的空间微环境，以及它们参与的癌症通讯基因网络。

样本与方法

●选取10个皮肤鳞状细胞癌患者的癌变组织和配对的正常组织，制备单细胞悬液，单细胞转录组测序（10X Chromium 3’ v2 kit），每个样本捕获2000-10000个单细胞，采用Illumina HiSeq 4000进行测序，平均测序深度为115,216 reads/cell。

●在上述的10个患者中，患者2，5，9，10做了空间转录组测序（10x Genomics Visium之前的版本），采取的是肿瘤样本，每个做了三张切片，采用illumina NextSeq 平台测序，平均测序深度为221million resds/样本；患者4，6做了Visium空间转录组测序，采取的也是肿瘤样本，每个做了两张切片，采用illumina NextSeq 平台测序，每个样本的测序深度为84-116 million。

研究结果

● 单细胞转录组分析

首先，作者对10个皮肤鳞状细胞癌患者的癌变和正常样本进行10x Genomics单细胞转录组测序，最终对获得的48,164个细胞的转录组数据进行聚类，鉴定出了肿瘤和正常上皮细胞以及基质细胞的亚型，包括成纤维细胞、上皮细胞、黑素细胞、内皮细胞、B细胞和浆细胞、NK细胞和T细胞、髓系细胞等。对其中的13,922个髓系细胞进一步细分，得到9个亚群。对1,763个NK细胞和T细胞进一步细分，得到11个亚群，这些结果与此前对实体瘤的研究一致。同时，全外显子组测序发现突变状态也与先前的cSCC研究一致。这些数据证明，该研究使用的cSCC样本具有代表性，可用于进一步分析。

随后，作者将10位患者的13937个正常角质细胞（Normal Keratinocytes）及7个患者的4883个癌变角质细胞（Normal Keratinocytes）进行进一步聚类分析，在正常皮肤中，作者观察到三个主要的角质细胞（KC）亚群，每个亚群均表达已知的代表性基因，而在癌变的角质细胞中，发现了一个新的肿瘤特异性细胞亚群（Tumor-Specific Keratinocyte,TSK），表达肿瘤特异性基因MMP10和PTHLH。进一步的富集分析显示， TSK中与细胞运动、细胞外基质分解、细胞外基质组织相关的基因存在高表达现象，这表明TSK细胞群与肿瘤侵袭高度相关。与此一致的是，TSK表达了经典的上皮细胞-间充质转化（EMT）标记基因，如VIM和ITGA5，以及Hallmark EMT基因signature（n=200）的高表达。

● 空间转录组分析

接着，作者使用空间转录组测序技术对肿瘤细胞群体进行了分析。在实验中，共获得了来自4个病人12个切片的8,179个spots的转录组数据。。其中，高TSK得分群的空间位置在spots中清晰可辨，各亚群的TSK得分差异及MMP10的表达差异也能明显地体现在spots中。此外，这些高TSK得分的亚群在不同患者中具有高相关性，证明结果具有普遍意义。进一步分析显示，在边缘清晰的肿瘤中（患者2、10），与TSK相邻的基质富含癌症相关的成纤维细胞和内皮转录物，说明此处是纤维血管的所在。同时，超过80％的高TSK得分点都位于肿瘤的边缘，其余的边缘斑点则富集了基础肿瘤基因，这些结果说明cSCC肿瘤边缘具有高度的异质性。

更进一步地，作者使用Visium空间基因表达解决方案，以更高的分辨率和密度从另外两个患者(患者4，6)肿瘤中获得了8,885个spots的转录组数据。在这些样本中，作者也观察到了与之前类似的结果，进一步验证了cSCC肿瘤边缘的异质性。

● 肿瘤边缘细胞间相互作用解析

作者整合了scRNA-seq和ST数据以表征边缘处的肿瘤细胞与相邻TME细胞之间的相互作用。基于配体-受体对数据库，TSK参与了广泛的自分泌和旁分泌相互作用，包括与肿瘤相关成纤维细胞（CAF），内皮细胞，巨噬细胞和髓系抑制性细胞（MDSC）等的相互作用。同时，在PD-1检查点抑制剂治疗两种类型鳞状细胞癌的临床试验中，TSK特异性基因ITGB1和PLAU的高表达与无进展生存期明显减少相关，证明了TSK细胞能够抑制抗肿瘤免疫。这表明，针对这一亚群或能改善免疫疗法。