高分利器｜单细胞 空间转录组 多重免疫荧光，揭示结直肠癌肝转移的免疫动态变化

肝转移（LM）是结直肠癌（CRC）死亡的主要原因，表现出高度的免疫微环境异质性和抑制性。 本研究使用10x Genomics单细胞 RNA-seq 和Visium空间转录组学对 97 个匹配的样本进行了测序。 值得注意的是，转移性微环境经历了显著的免疫抑制细胞空间重编程，如 MRC1+ CCL18 + M2 样巨噬细胞。本研究进一步开发了 scMetabolism，这是一种用于量化单细胞代谢的计算方法，并观察到这些巨噬细胞具有增强的代谢活性。有趣的是，新辅助化疗（NAC）可以阻断这种状态并恢复反应性患者的抗肿瘤免疫平衡，而无反应性患者则恶化为更具抑制性的状态。本研究描述了转移的免疫进化，并揭示了肿瘤如何对新辅助化疗做出反应。

本研究的样本来自于复旦大学中山医院收集的病理诊断为结直肠癌肝转移（CRLM）的样本。其中：

本研究通过10x Genomics单细胞技术共捕获了 178,630 个 CD45+ 细胞，平均每个样本包含2,007 个细胞，基因中位数为1064。经过细胞聚类分析，本研究定义了主要的细胞类型。与之前的结肠癌 scRNA-seq 基本一致。研究人员从 CRLM 样本中鉴定了髓细胞、CD8+ T 细胞、CD4+ T 细胞、NK 细胞和 B 细胞。值得注意的是，不同组织类型的 T 细胞比例明显不同，这表明了免疫微环境的组织异质性。在CRC 和配对的LM 中，Treg 细胞约占所有 CD45+ 细胞比例的 10% ，而这些细胞在相邻的正常组织中则很少。这表明肿瘤内免疫受到抑制，这之前归因于肝转移中免疫治疗效果的降低。

同时，本文开展了10x Genomics Visium空间转录组研究，通过无监督聚类分析将样品分为不同的区域，例如肿瘤和成纤维细胞区域。随后将 scRNA-seq 和 ST 数据利用Seurat软件进行整合，量化主要免疫亚群。该研究发现免疫微环境显示出从原发部位到转移部位的动态细胞和空间变化。在 新辅助化疗（NAC） 治疗后，免疫表型在有反应的患者中经历了抗肿瘤重塑，但在无反应的患者中转向更多的免疫抑制，其中免疫抑制细胞在转移部位重新编程。

2. 通过多种技术手段验证肿瘤免疫微环境特征

接下来本研究通过另外三个独立的 CRLM 队列来验证上述发现。首先本研究利用Akoya多重免疫荧光技术定量分析同一医院另外 27 名 CRLM 患者（n = 18，未治疗；n = 9，NAC-PR）中所选样本的免疫细胞亚群的空间分布。研究人员观察到，在未治疗的样本中， CRC 和 LM 中 FOXP3+ Treg 细胞、MRC1+ CCL18+ 巨噬细胞和 SPP1+ 巨噬细胞的浸润显著增加，这与前面的 scRNA-seq 数据基本一致。其次，本研究利用 ssGSEA 对 CRLM 的大量微阵列数据集中的免疫细胞进行评分。由于缺乏邻近组织数据，我们只能检查原发性和转移性肿瘤之间的细胞丰度。根据前面的 scRNA-seq 数据，在该验证队列中，MRC1+ CCL18+ 巨噬细胞、SPP1+ 巨噬细胞和中性粒细胞在转移性肿瘤中均显著更高。第三，本研究探讨了癌症基因组图谱 (TCGA) CRC 队列 中 scRNA-seq 定义的免疫细胞亚群的预后价值。MRC1+ CCL18+ 巨噬细胞和 SPP1+ 巨噬细胞在原发性肿瘤中的高评分均预测预后显著较差。总而言之，本研究的 CRLM 单细胞和空间免疫景观可以在独立的队列中得到验证，表明本研究数据的稳定性。这些观察结果还使我们假设特定的巨噬细胞亚群可能在 CRLM 的促肿瘤生态位形成中发挥重要作用。