【Immunity】10x单细胞多组学 Xenium原位分析助力阿尔茨海默病潜在治疗靶点的发现
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【Immunity】10x单细胞多组学 Xenium原位分析助力阿尔茨海默病潜在治疗靶点的发现
题目：An Exhausted-Like Microglial Population Accumulates in Aged and APOE4 Genotype Alzheimer’s Brains发表时间：2024.01
期刊：Immunity
影响因子：32.4
Doi:10.1016/j.immuni.2023.12.001
晚发性阿尔茨海默病(AD)的主要风险因素是高龄和APOE4基因变体。为了研究这些因素如何改变神经免疫功能，作者生成了一个综合的、纵向的单细胞大脑免疫细胞图谱，采用了携带三种常见人类APOE等位基因的AD模型小鼠。转录组和染色质可及性分析鉴定出一种反应性的小胶质细胞群，这些细胞同时表达炎症信号和细胞内应激标志物，且其频率随年龄和APOE4负担的增加而上升。在人类AD患者的大脑中也能检测到类似的细胞群，包括使用多重空间转录组学技术在皮质组织中发现的这种细胞群。作者将这种细胞群命名为终末炎症小胶质细胞(TIMs)。TIMs表现出Aβ清除能力的缺陷，并在Aducanumab治疗期间表现出细胞间通信的改变。TIMs可能代表了AD环境中炎症性小胶质细胞的一种衰竭状态，参与了APOE4携带者和老年人中的AD风险和病理，因此，TIMs为AD提供了一个潜在的治疗靶点。 1 单细胞RNA测序确定了AD小鼠的终末炎症性小胶质细胞状态
作者将5×FAD小鼠与小鼠Apoe位点中携带人APOE2、APOE3或APOE4等位基因的小鼠杂交以获得AD * APOE系（以下称为AD*APOE2、AD*APOE3和AD*APOE4)，然后取了10周、20周、96周龄并且具有不同APOE基因型的小鼠海马、皮质区域，使用10x Genomics的3’V3以及5’V2单细胞技术，获得了30868个细胞的单细胞图谱，通过对小胶质细胞进行进一步的分析，最终发现了一群终末期炎症小胶质细胞TIMs，它们几乎只存在于96周龄的小鼠中，尤其是携带APOE4的AD小鼠，并且后续还揭示了TIMs存在异质性(TIMs分为主要的2个亚型，高表达效应分子的effector-hi TIMs以及高表达应激分子的effector-lo TIMs)，并且这种异质性在阿尔茨海默病(AD)的背景下受到APOE基因型的影响。
图1 年龄和 APOE基因型依赖的AD神经免疫图谱2 TIMs是由不同的转录因子、细胞间接触和代谢途径来定义的
为了表征细胞图谱中TIMs和其他小胶质细胞群的驱动因素，使用SCENIC方法来重构基因调控网络，揭示TIMs和其他小胶质细胞群的特征。作者发现TIMs与由NF-κB和CEBP/P家族转录因子驱动的一系列炎症调节子以及多个AP-1家族转录因子强烈相关。有趣的是，TIMs在某些炎症调节子(如Nfkb 2, Irf 1, Irf 3, Irf 4)上富集，但在其他调节子(如Irf 5, Irf 7, Irf 9, Stat 1/2)上则相对减少，这表明TIMs具有独特的炎症表型。此外，TIMs在细胞间相互作用网络中预测的混杂性较低，暗示它们在局部环境中的促炎能力减弱。在代谢状态方面，TIMs显示出细胞能量学途径的降低，而某些代谢途径则有所增加，这定义了TIMs与其他小胶质细胞不同的代谢表型。 
图2 TIMs由独特的转录程序、相互作用组和代谢状态定义3 单细胞多组学测序揭示了TIMs中转录调控的介体
TIMs是一个独特的小胶质细胞群，仅出现在老年小鼠中，根据前面的细胞图谱数据，TIMs是如何转变以及基因的调控信息还不清楚，接下来作者取了60周龄AD*APOE4小鼠的CD45+细胞进行10x多组学(mRNA+ATAC)检测，以提高在这个60周龄的中间时间点检测到TIMs的可能性，最终获得了5081个细胞的多组学图谱，在这些60周龄小鼠中，发现了一种与TIMs特征相符合的基因表达程序，并且频率比20周龄小鼠更高，而比96周龄小鼠更少，说明TIMs在60周龄时已经达到可检查的水平。后续还发现ETS家族Motif在TIMs中相对与其他细胞群有独特富集，TIMs维持所必需的调控因子是FOS和Nfkb2,并且，利用多组学数据分析细胞间相互作用、代谢途径，验证了前面的结果，进一步支持TIMs在AD中处于一种炎症状态，并且有不同的代谢特征。图3 60周龄的 AD*APOE4 小鼠的多组测序可确定TIMs的调节特征4 TIMs在晚期人类AD中普遍存在，并因年龄和 APOE4 而富集
作者想知道TIMs是否是小鼠模型所特有的，利用Seurat将10个已发表的人脑SnRNA数据集与文中的多组学数据相结合，发现TIMs在10个数据集中都有被鉴定到，频率与多组学数据相当，并且无论是酶解还是Dounce研磨的样本处理方法，TIMs都有检测到，表明TIMs状态不是由于样本处理过程中体外应激产生的。接下来，作者探究了各种因素对TIMs频率的影响，发现AD患者样本中的TIMs比无疾病患者更丰富，特别是在疾病晚期和APOE4携带患者中，后续还发现与小鼠类似，TIMs的频率也随着年龄的增加而累积。
图4 TIMs在公开可用的人类snRNAseq数据集中检测到图5 TIMs在携带ApoE4的人类AD患者的皮质层中富集5 TIMs空间生态位在皮层中富集 Aβ 斑块和炎症细胞
为了进一步研究人AD背景下的TIMs,作者使用10x Xenium的Human Brain Gene Expression Panel(266个基因)，对3个APOE3纯合子和3个APOE4纯合子的人AD皮质组织进行组织原位转录组分析，最终覆盖到494376个单个细胞。作者发现在APOE3和APOE4供体中观察到了明确的TIMs簇，并且APOE4基因型的患者TIMs比例更高(22.7% VS 5.2%)。对6个供体样本进行细胞领域分析，发现TIMs比预期更有可能聚集在一起，并且与L5神经元和高APP或APOE转录本拷贝数的两种星形胶质细胞有更密切的邻近关系，此外，APOE4基因型的供体中的TIMs更倾向于与神经元和特定的星形胶质细胞群聚集，而APOE3基因型的TIMs则更常与白质中的少突胶质细胞相邻，这些发现表明APOE4基因型可能与TIMs频率增加以及它们与灰质更接近有关。作者还使用针对Aβ斑块的荧光染料对同一批用于Xenium分析的组织切片进行染色，以特异性检测Aβ斑块。通过比较两种方法的结果，他们发现TIMs存在于Aβ负荷高的区域，表明TIMs在Aβ相关发病机制中的潜在作用。6 TIMs表现出Aβ吞噬作用和清除能力的缺陷
作者取了60周龄不同基因型的小鼠海马、皮质组织的细胞，在体外用荧光标记和寡聚化的β淀粉样蛋白1-42处理，将CD45+并且荧光信号强和弱的细胞分为两组，进行5’V2单细胞转录组测序。结果发现TIMs，特别是effector-lo TIMs，在高Aβ池中显著减少，这表明它们在Aβ清除方面存在缺陷。AD*APOE4小鼠的effector-lo TIMs不仅在高Aβ池中更少，而且总体上的频率更高，这意味着该基因型的AD小鼠负担着特别受损的细胞群，导致Aβ清除能力更差。7 Aducanumab治疗可调节TIMs的频率和相互作用
Aducanumab是一种最近开发和批准的单克隆抗体疗法，可以选择性的结合Aβ聚集体来减缓疾病进展。作者取了60周龄的不同基因型小鼠进行aducanumab注射，将同型对照样本一起做单细胞转录组测序，结果显示Aducanumab治疗改变了AD模型小鼠的TIMs状态。Aducanumab治疗显著扩大了适应性免疫细胞(如CD8 T细胞和未成熟B细胞)的互作网络，尤其在APOE4动物中更为明显。effector-hi TIMs在信号传递中的增强表明它们可能是炎症期间细胞间通信的关键协调者，对于aducanumab疗法的适应性免疫响应起着中心作用。图8 Aducanumab治疗深刻地改变了AD环境中免疫细胞的格局文章中使用的单细胞技术想必大家都不陌生，而Xenium原位技术是10x Genomics公司推出的空间生物学平台，可以实现亚细胞分辨率的转录本检测，目前已经可以实现人和小鼠5K基因的检测。
