Cell | 单细胞测序 空间转录组 PhenoCycle空间蛋白组 mFISH 联用发现黑色素瘤ICB疗法耐药性评估新指标
免疫检查点阻断（ICB）疗法耐药性机制研究又有新突破！近日，来自比利时Leuven大学的研究团队在《Cell》杂志上刊稿了题为“A TCF4-dependent gene regulatory network confers resistance to immunotherapy in melanoma”的研究论文[1]。
研究者将单细胞技术与空间多组学技术联用，成功地“描绘”出ICB耐药性的黑色素瘤患者治疗过程中的肿瘤微环境变化图谱，并阐明了肿瘤细胞通过间质样转变实现免疫逃逸和治疗耐药的机制。
研究背景
肿瘤免疫检查点阻断（ICB）疗法是一类通过调节免疫效应细胞活性来特异性提高其抗肿瘤免疫反应的肿瘤治疗方法。特别是以PD-1/PD-L1和CTLA-4为代表的靶向T细胞的ICB疗法应用最为广泛。自从ICB疗法获批应用于晚期黑色素瘤治疗以来，近半数的转移性黑色素瘤（Metastatic melanoma，MM）患者在ICB治疗中获益。但是，仍有相当比例的MM患者对ICB疗法表现出耐药性。过去的10年中，大量研究表明导致MM患者ICB耐药性的机制多种多样，导致制定MM联合给药治疗方案的难度很大。不仅如此，由于MM肿瘤组织高度异质性的特征，在治疗前对患者进行ICB响应程度预判也尚未取得显著进展。
近年来，单细胞技术和空间多组学技术的发展有效提升了组织样本解析的维度，为疾病研究提供了新思路。本研究的作者就是利用单细胞测序和空间多组学技术，通过检测ICB治疗过程中MM肿瘤微环境中黑色素瘤细胞的异质性，阐明了MM患者ICB治疗耐药性的新机制。
研究思路
研究者巧妙地收集了23位MM患者ICB治疗前和早期治疗后（二次ICB给药前）的活检样本（其中20位患者同时收集到了治疗前和早期治疗样本，见图1A）。
研究者对收集到的样本依次进行单细胞测序（scRNA-seq）、空间转录组、PhenoCycler空间蛋白组（原CODEX）和多色原位杂交（mFISH）检测。值得一提的是，作者将同一切片样本先后通过PhenoCycler平台（完成空间蛋白组检测）和PhenoImager HT平台（原Vectra Polaris平台，完成mFISH检测）获得数据，并通过数据整合得到同一切片样本的原位空间多组学数据，建立了靶细胞的组织学检测体系，并实现了靶细胞与ICB疗法相关性的分析。另外，研究者还通过OT-I小鼠肿瘤治疗模型在临床前层面研究了ICB疗法优化的可能性。
研究过程
1. 利用单细胞测序分析MM患者肿瘤细胞异质性
首先，研究者利用scRNA-seq技术对治疗前和仅经过一轮ICB治疗的MM患者肿瘤活检样本来源的肿瘤单细胞数据进行解析（通过图1B所示多步质控法排除其他细胞干扰）。结果显示，入组患者样本中共存在11个黑色素瘤细胞簇（clusters，图1C）：抗原递呈（Antigen Presentation）、干扰素应激（Interferon αβ Response）、黑色素细胞（Melanocytic，MEL）、间充质样（Mesenchymal-like，MES）、神经嵴样（neural crest-like）、缺氧应激（Stress hypoxia response）、p53应激（Stress p53 response）、线粒体活跃（Mitochondrial）、有丝分裂（Mitotic）以及两个患者特异性簇（Patient Specific A和B）。
此外，基因特征分析、转录因子MITF（负责黑色素细胞状态调控）活性分析和拷贝数变异分析结果均表明黑色素瘤细胞簇之间出现基因重叠和混合，提示黑色素瘤细胞在微环境中的复杂异质性状态变化不受遗传因素调控（图1D-G）。这些结果解释了为什么治疗前检测无法提示患者的ICB治疗响应程度，因此下一步的研究关注点将指向微环境变化对肿瘤细胞状态的调节。
图1 MM患者活检样本单细胞测序
2. 通过空间组学获得MM患者空间细胞图谱，找出关键靶细胞
为了深入研究肿瘤微环境对黑色素瘤细胞的调控规律，研究者通过空间转录组技术分别分析了样本中细胞的空间分布规律。结果显示，除了MES细胞外的所有黑色素瘤细胞簇均表现出与微环境免疫反应状态相符的空间分布规律（图2）。而MES细胞的“出圈“也成功地得到了作者的进一步关注。
图2 MM患者活检样本空间转录组分析
接下来，研究者便着手建立MES细胞检测体系。为了应对肿瘤组织中黑色素细胞复杂的异质性，将MES细胞与肿瘤相关成纤维细胞（CAF）进行了比较，进而设计出多组学检测方案，有效地排除了结构细胞、免疫细胞和其他黑色素瘤细胞的干扰（通过CD45、CD31、S100A1，CDH19，SOX10，MITF，DCN，TCF4，LUM，THY1），实现了MES的组织学检测（图3）。值得注意的是，scRNA-seq结果和空间转录组结果均提示上皮间质转化调节相关的转录因子TCF4在MES细胞中的表达十分活跃，并与MITF表达成负相关，被作者设计在检测体系之中（图3D-E）。
图3 MM患者活检样本空间多组学分析
3.MES细胞富集与ICB疗法耐药性的临床相关性验证
接下来，研究者将MM患者MES的多组学检测结果与患者ICB治疗后的响应程度进行对比分析。结果表明，MES细胞和抗原递呈黑色素瘤细胞均能有效提示患者ICB疗法的响应程度（图4A-D）。不仅如此，研究者在另一个独立进行的乳腺癌患者实验结果中也发现了类似趋势（图4E-F）。
图4 MES细胞与ICB疗法响应相关性分析
4. TCF4调节MES的机制研究
最后，研究者在患者样本和小鼠模型中进一步探讨了上皮间质转化相关调控因子TCF4对黑色素瘤细胞向MES细胞转化的调控机制，并确定其结合位点（溴结构域和超末端结构域蛋白BRD4），阐明了ICB耐药患者肿瘤组织中MES细胞增多的机制。（详见原文）
总结
本研究通过单细胞-多组学技术联用找到了ICB治疗过程中肿瘤细胞免疫逃逸的关键细胞亚群及其调节机制，为肿瘤ICB疗法耐药性评估提供了新思路。
参考文献
1. Pozniak J, Pedri D, Landeloos E, et al. A TCF4-dependent gene regulatory network confers resistance to immunotherapy in melanoma. Cell. 2024 Jan 4;187(1):166-183.e25.
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