Nature | 单细胞核测序 空间转录组 空间蛋白组，实现6个癌种异质性 2D 3D空间分析

2024年10月30日，来自美国华盛顿大学和普林斯顿大学的几个研究团队在《Nature》（IF 50.5）杂志上发表了题为 “Tumour evolution and microenvironment interactions in 2D and 3D space”的研究论文[1]。该研究将单细胞核RNA测序（snRNA-seq）、空间转录组技术和PhenoCycler空间蛋白组技术（原CODEX）结合，实现6种类型肿瘤样本的3D空间多组学分析，从肿瘤克隆演化角度揭示了肿瘤演进过程中“冷/热“微区域变化和免疫抑制的机制。

肿瘤克隆演化（Clone Evolution）理论关注肿瘤在时间和空间上对变化的适应性过程，以及肿瘤对治疗刺激下的微环境改变做出的反应。这一过程涉及突变的积累和基于环境适应的选择，从而推动肿瘤的生长和病理性演进。在癌症的病理性演进过程中，治疗抵抗性亚克隆的出现通过多种机制增强了肿瘤对治疗的抵抗。

以往的研究由于受到技术限制，多集中在基于突变的演化推断。尽管传统的bulk测序和单细胞技术能提供关于肿瘤遗传和分子特征的大量信息，但它们无法保留肿瘤空间动态分析所需的样本相关信息。

相比之下，空间组学技术，如空间转录组和空间蛋白组技术，可以从空间维度解析肿瘤微环境，提供了肿瘤空间异质性观察的新视角。通过空间转录组技术，研究者能够更细致地检查肿瘤的细观克隆结构，并识别细胞与微环境之间的相互作用。结合PhenoCycler空间蛋白组技术（原CODEX）在样本原位定位蛋白，使得研究人员更全面地理解肿瘤的分子和空间特征。

为了探讨肿瘤在2D和3D空间中的克隆进化及其与微环境间的相互作用，研究团队通过单细胞核RNA测序（snRNA-seq）、空间转录组技术和PhenoCycler空间蛋白组技术（原CODEX），对78个病例（来源是NCI的人类肿瘤图谱网络课题）中的131个肿瘤切片进行了全面的分析。样本涵盖了6种癌症类型，包括乳腺癌（BRCA）、结直肠癌（CRC）、胰腺导管腺癌（PDAC）、肾细胞癌（RCC）、子宫体子宫内膜癌（UCEC）和胆管癌（CHOL）。

值得一提的是，研究人员通过间隔切片数据重构的方式，实现了样本3D层面数据的获取（图1）。

图1 病理染色+空间转录组+空间蛋白组3D分析技术路线

本研究中设计了一组19+29（19种细胞亚群分型标志物+29种肿瘤类型特异性标志物）抗体的PhenoCycler检测方案实现了不同类型肿瘤的空间蛋白组检测，具体方案如下（图2）：

图2 本研究PhenoCycler实验方案设计

1. 建立跨癌种空间微区域研究体系

为了在跨癌种样本队列中研究肿瘤的空间异质性，首先对6种不同癌症类型的131个肿瘤切片进行了深入的空间转录组分析，并通过Morph工具集进一步细化了肿瘤边界，确定了斑点（Spots）与边界的距离，并构建了斑点层，将其深度索引到肿瘤边界。

研究人员选择了具有多个肿瘤邻域的50个切片作为“空间上不同的队列”和具有弥漫性肿瘤邻域的82个样本作为“空间弥漫队列”。根据每个肿瘤微区域的估计面积，将微区域大小分类为小、中、大三个类别。

结果表明，与转移瘤相比，原发性肿瘤在微区域大小和空间分布上存在差异，这表明器官特异性的肿瘤微环境对肿瘤微区域的生长和空间分布有影响。在此基础上，研究人员还制作了15个肿瘤组织块的连续切片，得到了48个适合多组学3D肿瘤重建的样本（图3）。

随后，还利用CalicoST和InferCNV工具对全基因组复制数变异（CNV）进行了分析，并结合全外显子组测序（WES）数据，筛选出每个微区域中的关键CNV事件，将微区域聚类为空间亚克隆，并在多种癌症类型中鉴定出具有特定CNV特征的多个空间亚克隆（详见原文）。

图3 肿瘤的空间微区域

2. 肿瘤微区域的2D多组学联用分析 

随后，利用肿瘤空间微区域研究体系对肿瘤-微环境之间的相互作用进行深入分析。结果表明，不同癌症类型中特定的非肿瘤细胞类型（如BRCA中的巨噬细胞、CRC和PDAC中的成纤维细胞）显示出显著的浸润差异。

此外，还在空间邻域分析的基础上总结出样本肿瘤和非肿瘤区域中的多种细胞聚集模式。通过COMMOT分析，还量化了空间基因和细胞间通讯（CCI），发现边界区域富集的CCI包括ECM受体、分泌信号和细胞间粘附分子（图4）。

图4 空间肿瘤微区域内的免疫和基质浸润

3. 肿瘤微区域的3D多组学分析 

为了研究 3D组织中的肿瘤生长模式及其与微环境的相互作用，研究人员利用PASTE2工具，共注册了48个切片数据并构建了肿瘤的三维体积模型。通过多组学分析还原了不同样本间肿瘤体积数量的3D结构，特别是表现出明显的微型导管状肿瘤生长模式的样本。

研究中还使用了连通性和环数两个拓扑指标来分析肿瘤体积的结构复杂性（连通性指标衡量肿瘤体积与相邻微区域的连接数量，而环数指标则表示相邻切片分裂和合并形成复杂结构的实例），在3D结构上还原了这些肿瘤中频繁形成的复杂分支结构（图5）。

图5  3D肿瘤体积重建揭示了不同的肿瘤生长模式

最后，采用无监督深度学习方法来识别序列切片多组学数据集中的3D细胞邻域。首先对空间转录组、空间蛋白组和H&E染色数据进行了视觉变压器（ViT）自动编码器的训练，然后使用带注释的图像块构建3D细胞邻域，从而在多个切片中分析这些邻域。

结果表明，这些3D肿瘤富集邻域和微环境邻域与先前定义的2D空间亚克隆几乎重叠，且部分3D细胞邻域的分布规律与免疫应答和基质基因的表达相关。此外，通过对比免疫冷和免疫热区域，进一步验证了这些邻域的免疫基质状态，并发现这些区域在细胞类型组成上存在显著差异。

图6 微区域边界的肿瘤-微环境相互作用3D分析

这项研究将单细胞技术、空间转录组技术和空间蛋白组技术联用，实现了多种实体肿瘤样本的3D空间多组学分析，深入探讨了肿瘤与微环境之间的相互作用在克隆演进过程中发挥作用的机制，为肿瘤异质性解析提供了新视角。

参考文献

1. Mo CK, Liu J, Chen S, et al. Tumour evolution and microenvironment interactions in 2D and 3D space. Nature. 2024 Oct;634(8036):1178-1186.