Cancer Cell | 南开大学院士团队揭示靶向CD28/PD-L1促进三阴性乳腺癌（TNBC）肿瘤免疫治疗新机制
近日，南开大学免疫研究所的曹雪涛院士团队在《Cancer Cell》（IF 48.8）杂志上发表了题为 “Inhibiting intracellular CD28 in cancer cells enhances antitumor immunity and overcomes anti-PD-1 resistance via targeting PD-L1（抑制癌症细胞内CD28通过靶向PD-L1增强抗肿瘤免疫并克服抗PD-1耐药性）”的研究论文[1]。通过小鼠三阴性乳腺癌（TNBC）模型中的全基因组CRISPR筛选，揭示了癌细胞内CD28招募SNRPB2促进CD274的mRNA稳定性，从而上调PD-L1表达的分子机制。该研究以CD28为突破口，为开发新的免疫治疗策略提供了新思路。
研究亮点
🔹体内CRISPR 筛选明确CD28 驱动癌细胞的免疫逃逸
🔹癌细胞中的 CD28 缺失激活 cDC1 和 CD8 T 细胞抗肿瘤反应
🔹细胞内 CD28 结合并稳定 CD274 mRNA促进 PD-L1 上调
🔹靶向 CD28 抑制肿瘤生长并克服抗 PD-1 耐药性
研究背景
免疫检查点阻断（ICB）疗法是一种通过抑制免疫检查点分子（如PD-1）的相互作用来激活免疫系统对肿瘤细胞的杀伤，从而治疗癌症的方法。虽然ICB疗法在改善恶性肿瘤患者的治疗结果方面取得了进展，但大多数癌症患者对ICB治疗的响应有限。为了提高ICB的疗效，研究者们正在努力揭示ICB耐药机制，特别是癌细胞内在因素在免疫逃逸中的作用。多种因素导致ICB治疗耐药，包括特定肿瘤基因突变、肿瘤抗原下调、免疫抑制分子以及肿瘤微环境（TME）中的细胞。
三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性强、预后差的乳腺癌亚型，对现有的免疫疗法响应不佳。TNBC的耐药机制复杂，涉及低免疫原性和免疫抑制分子如PD-L1的升高。因此，调控肿瘤内在因素以增强肿瘤免疫原性和重新编程肿瘤微环境，特别是通过激活CD8+ T细胞将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤，是克服TNBC免疫治疗耐药的策略之一。
CD28是一种经典的共刺激分子，在小鼠T细胞中稳定表达，在大约80%的人类CD4+ T细胞和50%的人类CD8+ T细胞中表达。CD28的传统功能是与B7配体结合后启动T细胞内的共刺激信号。通常认为CD28发挥维持T细胞存活、增殖和向特定T细胞亚群分化的作用。也有研究指出，CD28还能通过翻译后修饰和表观遗传机制调节T细胞分化和功能。然而，CD28在非T免疫细胞、基质细胞甚至肿瘤细胞中的潜在作用尚不清楚。
研究方法
本研究通过体内全基因组CRISPR失活筛选，在小鼠三阴性乳腺癌（TNBC）模型中，揭示了CD28在癌细胞中的非经典功能（促进肿瘤免疫逃逸）。具体来说，研究人员使用了123,666个探针对20,611个基因和1,000个非靶向控制sgRNA的小鼠慢病毒敲除文库（mGeCKOv2）。在经过14天的普鲁霉素筛选后，携带mGeCKOv2的小鼠乳腺癌细胞系4T1细胞被接种到免疫健全的BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中。在接种后的6、8和10天收集肿瘤细胞进行sgRNA测序，以体外经过14天普鲁霉素筛选的4T1细胞（P14）作为对照（图1A）。研究人员还采用了药物诱导的CD28敲低、流式细胞术、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、免疫荧光、多重免疫荧光（mIF）和免疫组化等技术，以深入研究CD28在肿瘤免疫逃逸中的作用。
本研究采用PhenoImager平台实现TNBC患者TMA样本的多重免疫荧光（mIF）检测，抗体组合为：pan-CK、CD28、SNRPB2、CD4、CD8和GZMB。
研究过程
1. 用体内全基因组CRISPR筛选确定CD28是免疫逃逸和肿瘤生长的潜在靶点
为了确定肿瘤免疫逃逸和肿瘤生长过程中发挥关键作用的分子，在小鼠三阴性乳腺癌模型中进行体内全基因组CRISPR-Cas9失活筛选。结果表明，敲除癌细胞中的CD28可以激活抗肿瘤CD8+ T细胞反应，抑制肿瘤生长，并克服对PD-1抗体的抗性（图1）。
此外，研究还揭示了CD28在癌细胞中的非典型定位，主要在细胞质和核中，以及其通过招募SNRPB2来促进Cd274 mRNA稳定性，从而上调PD-L1表达的分子机制（图1）。这些发现表明，CD28是癌细胞免疫逃逸和肿瘤生长的潜在靶点，为开发新的免疫治疗策略提供了重要信息。
图1 体内全基因组CRISPR筛选发现癌细胞CD28是免疫逃逸和肿瘤生长的潜在靶点
2. 研究CD28在抗肿瘤免疫反应中的作用和机制
随后利用CD28敲除的乳腺癌细胞系研究CD28缺失对肿瘤细胞生长及抗肿瘤免疫反应的影响。结果表明，这种敲除能显著抑制肿瘤在体内的生长，并延长荷瘤小鼠的存活时间。此外，敲除CD28的肿瘤细胞能够诱导出特定的抗肿瘤T细胞免疫反应，且这种反应主要依赖于CD8+ T细胞（图2）。
图2 癌细胞中CD28缺失减弱了肿瘤生长
研究人员检测了CD28在肿瘤微环境形成中的作用。结果表明，CD28的缺失导致cDC1和CD8+ T细胞在肿瘤中的富集。不仅如此，CD28敲除的肿瘤表现出更高的IFNg表达水平，表明T细胞的激活增加。scRNA-seq分析结果表明，CD28敲除通过增加cDC1_Dcstamp和CD8+ T细胞亚群等方式影响肿瘤微环境，减弱肿瘤的免疫逃逸能力和增强抗肿瘤免疫反应（图3）。
以上发现证实了CD28在调节肿瘤免疫微环境中的关键作用，并为开发新的免疫治疗策略提供了潜在的靶点。
图3 CD28 KO肿瘤中cDC1和CD8+T细胞浸润和功能增强
3.研究CD28在肿瘤免疫治疗中的应用潜力
接下来，在小鼠模型中进一步研究干预CD28对免疫治疗靶点的影响。研究人员通过多西环素诱导在癌细胞中敲低CD28能够有效地抑制肿瘤的生长，并且能够克服对PD-1疗法的耐药性。敲低CD28影响了肿瘤微环境中的免疫细胞组成，特别是增加了CD8+ T细胞的浸润，并降低了PD-L1的表达。此外，研究还发现CD28可以直接与CD274 mRNA结合，并通过招募SNRPB2来稳定该mRNA，从而上调PD-L1的表达。（详见原文）
为了进一步确定上述发现的临床意义，研究人员收集了411个不同亚型乳腺癌临床样本并通过mIF分析了癌细胞CD28表达及其与免疫细胞浸润的相关性。结果表明，在人类乳腺癌组织中，癌细胞的高CD28表达与PD-L1的高表达、CD8+ T细胞浸润的减少以及患者预后不良相关。研究发现，在三阴性乳腺癌中，随着临床分期的增加，癌细胞中CD28的表达水平上升，并且与CD8+ T细胞浸润呈负相关（图4）。CD28表达水平高的癌细胞倾向于有更多的PD-L1表达，这可能有助于癌细胞逃避免疫系统的监控和杀伤。
图4 临床样本中高CD28表达与PD-L1表达增加、CD8+T细胞浸润减少和预后不良相关
总结
这项研究首次揭示了CD28促进免疫逃逸的非经典功能——通过直接结合CD274 mRNA并招募SNRPB2来稳定mRNA，从而增加PD-L1的表达。这一发现为乳腺癌等癌症的免疫治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略。
参考文献
1. Yang Z, Liu X, Zhu J, Chai Y, Cong B, Li B, Gao W, Hu Y, Wen M, Liu Y, Fu L, Cao X. Inhibiting intracellular CD28 in cancer cells enhances antitumor immunity and overcomes anti-PD-1 resistance via targeting PD-L1. Cancer Cell. 2024 Dec 3:S1535-6108(24)00443-4. doi: 10.1016/j.ccell.2024.11.008. Epub ahead of print. PMID: 39672166.
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