客户文章 （IF=20.5）| 10x单细胞转录组学助力分析PROTAR疫苗诱导的B细胞免疫反应
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客户文章 （IF=20.5）| 10x单细胞转录组学助力分析PROTAR疫苗诱导的B细胞免疫反应
广州云准科技（AccuraMed）参与了本篇文章的单细胞转录组测序和数据分析工作，本文包含公司团队洪博署名，感谢来自客户的认可和信任，再次祝贺!!!
文章题目：Proteolysis-targeting influenza vaccine strains induce broad-spectrum immunity and in vivo protection
中文题目：蛋白水解靶向流感疫苗株诱导广谱免疫和体内保护
发表期刊：Nature microbiology
影响因子：20.5（JCR 1区Q1）
发表时间：2025年01月15日
云准提供的服务：10x scRNA-seq、scBCR-seq测序及分析
发表单位：中国科学院深圳先进技术研究院
- 由于安全性和免疫原性的考虑，从完整病毒中生产有效的活疫苗仍然具有挑战性。需要可以系统地应用的方法。在这里，我们通过使用多种细胞 E3 泛素连接酶生成蛋白水解靶向 （PROTAR） 甲型流感病毒，创建了一个减毒活流感疫苗库。
- PROTAR 病毒经过工程改造，可被泛素-蛋白酶体系统减毒，该系统介导常规宿主细胞中的病毒蛋白降解，但允许在工程细胞系中进行高效复制以进行大规模生产。根据 degron-E3 连接酶对的不同，病毒表现出不同程度的衰减。
- 在动物模型中，PROTAR 病毒高度减毒并引发了稳健、广泛、菌株依赖性的体液、粘膜和细胞免疫。此外，它们还针对同源和异源病毒攻击提供了交叉反应性保护。本研究为开发安全有效的疫苗提供了一种系统的方法，在设计针对其他病原体的减毒活疫苗方面具有潜在应用。
文章中研究者将蛋白酶体靶向降解子（PTD）融合到流感病毒的M1蛋白上，并通过TEV蛋白酶切割位点（TEVcs），将PTD序列插入流感病毒基因组的M1蛋白C末端，并在PTD与病毒蛋白之间插入TEV蛋白酶切割位点（TEVcs）。在表达TEV蛋白酶的细胞中，PTD被切割，病毒蛋白得以稳定，从而允许病毒高效复制。利用单细胞技术主要对感染流感病毒或接种疫苗后的小鼠脾脏 B 细胞进行分析，从基因表达和受体序列层面探究 B 细胞在免疫反应中的变化，为评估 PROTAR 疫苗效果提供依据。1、PROTAR甲型流感病毒的产生及PROTAR病毒减毒机制的表征在本文设计中，利用细胞内的E3泛素连接酶，通过在流感病毒蛋白（如M1蛋白）上融合蛋白酶体靶向降解子（PTD），使病毒蛋白在常规细胞中被降解，从而实现病毒减毒。文中使用HEK293T、MDCK.2等细胞系进行病毒的培养和扩增，接着进一步通过TCID50（半数组织培养感染剂量）实验测定病毒滴度，评估病毒在不同细胞系中的复制能力。在MDCK-TEVp细胞中，所有病毒均表现出高效生长，最终病毒滴度为104.7–108.8 TCID50 ml−1（图1），表明MDCK-TEVp细胞的生产效率很高。相比之下，在MDCK.2细胞中，这些PROTAR病毒表现出广泛的复制动力学，与野生型（WT）病毒相比，它们的生长明显减弱（图1）。这些数据表明，在表达TEVp的细胞中大规模生产的强大复制和在传统细胞中的显著衰减。此外，所有PROTAR病毒在基因上都是稳定的。（图2）的实验结果为PROTAR疫苗的设计提供了重要依据，通过验证M1蛋白的降解依赖于UPS和PTD，研究者确认了PROTAR疫苗的减毒机制是通过宿主细胞的泛素-蛋白酶体系统（UPS）实现的。图1.WT病毒和PROTAR病毒在MDCK-TEVp和常规MDCK.2细胞中的生长曲线 通过人类肺部类器官芯片模型，全面评估了PROTAR疫苗的安全性和免疫反应特性。实验结果表明，PTDβ-TrCP病毒在人类肺部类器官芯片中复制能力极低，滴度显著低于WT病毒，PTDβ-TrCP病毒引起的PBMCs招募和细胞因子分泌显著低于WT病毒，表明其安全性更高，该模型成功模拟了人类肺部的生理结构和功能，为评估疫苗的安全性提供了一个高度相关的体外平台。
PROTAR疫苗在体内（小鼠模型）的安全性评估结果，PROTAR病毒接种的小鼠在实验期间体重没有显著下降，且全部存活，表明其对小鼠无致死性。PROTAR病毒在小鼠肺部的复制能力极低，滴度低于检测限，进一步证明其高度减毒。这些结果表明，PROTAR疫苗在体内具有良好的安全性，为后续的免疫原性和保护效果评估提供了基础。研究了PROTAR疫苗在小鼠中诱导的体液免疫、粘膜免疫和细胞免疫反应，并通过单细胞转录组学技术揭示了这些PROTAR疫苗诱导的免疫反应水平是菌株依赖性的，并且与PTD介导的抗原呈递水平部分相关，一致地，对B细胞反应的更深入分析表明，PROTAR疫苗可以诱导流感特异性B细胞反应，包括生发中心（GC）、记忆和血浆B细胞反应对B细胞克隆形成的不同影响（图5、图6），这些细胞在疫苗接种后能够长期存在，并在再次感染时迅速响应，提供持久的保护。BCR克隆性分析显示，PROTAR疫苗诱导了广泛的B细胞克隆性扩张，这表明疫苗能够激活多种B细胞克隆，从而产生多样化的抗体库，进一步增强了免疫反应的广谱性和持久性，利用了多种E3泛素连接酶，可以根据不同人群的遗传背景选择合适的疫苗。结论表明，PROTAR疫苗不仅能够诱导强大的免疫反应，还具有广泛的免疫覆盖范围和交叉保护能力。 图5.PROTAR疫苗在成年小鼠中诱导的B细胞反应的特征图6.雷达图显示了接种指定PROTAR疫苗或未接种疫苗的小鼠的幼稚、GC、记忆和PB B细胞中IGHV基因使用的相对变化
通过在小鼠中进行同源和异源病毒挑战实验，评估PROTAR疫苗的保护效果。结果显示，单剂量的PTDβ-TrCP疫苗能够完全保护小鼠免受同源WT WSN病毒和异源H3N2病毒的致死性感染。此外，该疫苗在老年小鼠和具有预先流感免疫力的小鼠中也表现出良好的保护效果。图7.成年小鼠对同源和异源野生型病毒致命攻击的交叉反应保护 在这项研究中，单细胞转录组测序被用于深入分析PROTAR疫苗对小鼠B细胞反应的影响，揭示了疫苗诱导的免疫应答的细胞异质性和动态变化。通过分析B细胞亚群的异质性、BCR克隆性扩张以及免疫应答的动态变化，研究者能够更深入地了解疫苗的免疫原性机制，这些发现不仅为流感疫苗的设计提供了新的理论依据，还为未来开发更有效的疫苗策略提供了重要的参考。【1】Shen J, Li J, Shen Q, Hou J, Zhang C, Bai H, Ai X, Su Y, Wang Z, Zhang Y, Xu B, Hao J, Wang P, Zhang Q, Ye AY, Li Z, Feng T, Li L, Qi F, Wang Q, Sun Y, Liu C, Xi X, Yan L, Hong H, Chen Y, Xie X, Xie J, Liu X, Du R, Plebani R, Zhang L, Zhou D, Church G, Si L. Proteolysis-targeting influenza vaccine strains induce broad-spectrum immunity and in vivo protection. Nat Microbiol. 2025 Jan 15. doi: 10.1038/s41564-024-01908-2. Epub ahead of print. PMID: 39815008.
文案：李秋燕
